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病毒病严重影响苹果的生长、产量以及果品质量,尚无有效防治药剂,树体一旦侵染很难根除,繁育无病毒苗木实行无毒化栽培是其防治的最有效途径。高效、灵敏、稳定的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的重要技术保障之一。本研究在筛选出适用于苹果的内参基因的基础上,分别建立了苹果Actin基因及苹果茎沟病毒、茎痘病毒、褪绿叶斑病毒三种苹果潜隐性病毒的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,旨在为进一步研究三种潜隐性病毒的侵染、增殖、分布以及时序变化等规律提供有效的技术手段,并为苹果病毒的多重实时荧光定量RT-PCR检测体系的研发奠定基础。主要研究结果如下:1、本研究采用SYB GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,对Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六个持家基因在苹果幼叶、成龄叶、枝皮、根皮和种子中的表达量进行了检测。经GeNorm软件分析发现,6个内参基因在五种不同组织器官中的表达稳定性由高到低排列顺序为:Actin=UBQ﹥GAPDH﹥nad5﹥TUB﹥18SrRNA,Actin和UBQ为优选内参基因。2、首次建立了苹果Actin基因的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据已公布的Actin基因序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。结果显示建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为106.5%;该方法的引物和探针特异性强;检测灵敏度为1.48×10 copies·μL-1的cRNA,比常规RT-PCR高1000倍;重复性好,组内和组间重复变异系数均小于2.65%。3、建立了苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ASGV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为96.8%;该方法特异性好,与苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为10copies·μL-1,比常规RT-PCR高1000倍;组内和组间重复变异系数均小于1%。表明该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASGV的快速准确检测。4、建立了苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ACLSV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与ASGV、ASPV和ASSVd均无交叉反应;灵敏度为100 copies·μL-1,比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于0.84%。表明TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。5、建立了苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ASPV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与ASGV、ACLSV及ASSVd均无交叉反应;其最低检测限为1.31×102 copies·μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASPV的快速定量检测。