一、课题的研究目的及意义戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)感染引起的急性传染病，主要流行于亚洲、非洲和中美洲一些发展中国家，在墨西哥、印度、巴基斯坦、尼泊尔等国家已发生数次爆发流行。戊型肝炎病毒感染易发展成暴发性肝炎，病死率较高，孕妇戊型肝炎病死率高达15％～25％，对人类健康构成很大威胁。虽然经过多年探索，但还没有成功的HEV细胞培养模型和HEV感染小动物模型，这对研究戊型肝炎造成很大障碍。目前对HEV侵入肝细胞的机制，病毒在体内的复制情况，HEV引起肝脏损伤的机制，孕妇感染HEV后高病死率的原因都了解甚少，从而为戊型肝炎的防治特别是重型戊型肝炎的治疗带来很大困难。至今戊型肝炎在临床上尚无有效治疗方法，重型戊型肝炎病死率相当高，进一步研究戊型肝炎发病机制，可为其治疗提供实验基础和药物靶点，在理论和实践上均具有重要意义。HEV基因组为线状单股正链RNA，全长7.2～7.6kb，包含3个开放读码框架(open reading frame，ORF)即ORF1、ORF2、ORF3。其中ORF3位于结构区的ORF1和ORF2之间，5端与ORF1重叠1bp，3′端与ORF2重叠328 bp，由369bp组成，起始端含起始密码子AUG，可独立编码蛋白质。ORF3蛋白全长123个氨基酸(aa)，分子量约13.5 kD，目前对ORF3蛋白的功能了解甚少，体外结合实验表明，不同基因型HEV ORF3蛋白可与多种信号转导蛋白结合，初步研究提示其可能与宿主细胞信号蛋白发生相互作用。当前信号转导异常同人类疾病的关系是生命科学研究的前沿领域。越来越多的证据表明，病毒致病即源于病毒蛋白所致宿主细胞内信号转导的紊乱，其通过蛋白质-蛋白质的相互作用而调控细胞内信号分子的生物活性，进而激活相关信号转导通路，促进或抑制相关基因的转录表达，改变宿主细胞的生物学特性，在病毒致病中发挥重要作用。我们提出HEV ORF3蛋白通过激活细胞内信号分子及相关信号转导通路可能为病毒在体内复制及致病的分子机制之一。本课题通过构建HEV ORF3真核表达载体pcHEV3，然后将pcHEV3转染HepG2细胞表达ORF3蛋白，检测其对细胞内PI-3K-Akt信号转导通路的影响，初步揭示HEV感染所致细胞内信号转导异常与HEV致病性的关系，为防治戊型肝炎提供新的理论基础和思路。二、研究方法1．从实验感染戊型肝炎病毒新疆株的猕猴胆汁中用Trizol试剂提取HEVRNA；2．以猕猴胆汁中提取的HEV RNA为模板，用逆转录法合成HEV cDNA；3．根据已经报道的我国HEV新疆株cDNA序列，分别设计与ORF3 5′端和3′端序列相互补的引物。在其5′端引入EcoR I酶切位点，3′端引入Xho I酶切位点。使用PCR方法扩增HEV ORF3 cDNA片段，PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，确定是否扩增出预期长度HEV ORF3 cDNA片段；4．用QIAquick Gel Extraction kit从电泳后的琼脂糖凝胶中回收HEV ORF3 cDNA片段；5．用EcoR I／Xho I双酶切真核表达载体pcDNA3和HEV ORF3 cDNA片段，pcDNA3酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，确证pcDNA3完全线性化，剩余酶切产物用QIAquick Gel Extraction Kit回收；6．用T4 DNA连接酶连接pcDNA3酶切产物和HEV ORF3 cDNA酶切产物，??构建HEV ORF3蛋白真核表达重组载体pcHEV3；7．用重组载体pcHEV3转化大肠杆菌，将转化的细菌转种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养平板上，经氨苄青霉素抗性初步筛选后，挑取单个菌落增菌培养；8．用碱裂解法提取质粒pcHEV3，EcoR I／Xho I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，观察ORF3 cDNA是否插入到了pcDNA3载体中；9．将插入HEV ORF3 cDNA的重组质粒pcHEV3进行DNA测序，鉴定重组质粒中ORF3 cDNA序列的完整性及正确性；10．将重组质粒pcHEV3用脂质体转染HepG2细胞，细胞分为4组：第1组转染重组质粒pcHEV3；第2组转染质粒pcDNA3；第3组转染重组质粒pcHEV3(预先加入PI-3K抑制剂LY294002)；第4组未转染质粒；11．将pcHEV3转染至HepG2细胞，48h后固定，用间接免疫荧光法原位检测ORF3蛋白表达及细胞内定位；12．将pcHEV3转染至HepG2细胞，48h后用1％NP-40细胞裂解缓冲液裂解细胞，Western blot检测细胞内磷酸化AKt；13．将pcHEV3转染至HepG2细胞，48h后用低渗缓冲液裂解细胞，提取和制备核蛋白，电泳迁移变动实验检测NF-κB的核转位及活化。三、结果1．从实验感染戊型肝炎病毒新疆株的猕猴胆汁中克隆出HEV ORF3全长cDNA片段；2．经酶切鉴定及DNA测序鉴定，成功构建出HEV ORF3蛋白真核表达重组载体pcHEV3；3．HepG2细胞转染重组质粒pcHEV3后，能表达ORF3蛋白，且ORF3蛋白主要分布在细胞浆中；4．HepG2细胞表达ORF3蛋白后，磷酸化Akt明显增多，且Akt磷酸化依赖于ORF3蛋白对PI-3K的激活；5．HepG2细胞表达ORF3蛋白后，细胞核内NF-κB明显增多，且NF-κB核转位依赖于ORF3蛋白对PI-3K-Akt信号转导通路的激活。四、结论1．HepG2细胞转染重组质粒pcHEV3后，能表达ORF3蛋白，且ORF3蛋白主要分布在细胞浆中，可以作为研究病毒蛋白与宿主细胞相互作用的有效工具和方法；2．HepG2细胞转染重组质粒表达HEV ORF3蛋白后，蛋白激酶Akt发生磷酸化而激活，且Akt的激活依赖于PI-3K的活化；3．HEV ORF3蛋白可通过PI-3K-Akt信号转导通路激活NF-κB，使其从细胞浆转位到细胞核，发挥转录调控作用，NF-κB调控的众多基因产物在炎症反应中发挥关键作用，提示戊型肝炎病毒感染人体后的肝细胞损伤可能与NF-κB活化后的炎症反应有关；4．PI-3K抑制剂LY294002可阻断HEV ORF3蛋白对细胞内PI-3K-Akt信号转导通路的激活，并可通过Akt间接抑制NF-κB的活化及核转位，阻断其转录调控作用；5．戊型肝炎病毒感染人体后，可能通过表达ORF3蛋白，激活细胞内PI-3K-Akt信号转导通路，PI-3K-Akt信号转导通路的激活可能与病毒复制、肝细胞炎症反应及肝脏病变有密切关系，通过调节PI-3K-Akt信号转导通路，有可能发现新的药物靶点，为戊型肝炎的治疗提供新的方向和思路。