食物过敏是全世界关注的食品安全问题之一,并且患病率呈现逐年递增的趋势。蟹类具有重要的经济价值和营养价值,广受消费者喜爱,但其引起的食物过敏问题也不容忽视。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）作为我国东南沿海地区的重要水产资源,其食物过敏病例也日益增多。本研究以拟穴青蟹为实验对象,对青蟹肌肉过敏原磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase,TIM）的晶体结构、交叉反应性及抗原表位进行分析,同时利用定点突变技术改变TIM致敏性,以期获得低免疫结合活性的TIM突变蛋白,为甲壳类水产品分子诊断及免疫治疗奠定基础。本研究首先对拟穴青蟹重组TIM进行体外表达,利用悬滴法获得蛋白质晶体,并对沉淀剂浓度、缓冲溶液pH值等结晶条件进行优化,确定结晶条件为蛋白浓度20 mg/mL、0.1M citric acid（pH 4.6）、22%PEG 6000;进一步通过X射线衍射获得分辨率为1.8?的TIM晶体,其结构呈现二聚体且单体为（β/α）₈筒状;晶体结构分析结果表明,拟穴青蟹TIM具有高度保守的一级、二级结构,且筒状内部β折叠在不同物种间较为保守,筒状外侧α螺旋区域则为可变区;拟穴青蟹TIM与凡纳滨对虾TIM三级结构叠加,发现两者差异主要位于α螺旋及loop区域;Western blot结果分析显示,5种甲壳类水产品TIM均与兔抗拟穴青蟹TIM多克隆抗体具有交叉反应性;将已报道的拟穴青蟹TIM抗原表位在晶体结构中进行定位,发现线性表位多分布于α螺旋区域,构象表位及关键氨基酸分布于筒状结构下侧的loop区域,便于与抗体接触。以本实验室鉴定的拟穴青蟹TIM构象表位关键氨基酸为基础进行定点突变,构建突变型TIM表达载体,经纯化并采用兔抗拟穴青蟹TIM多克隆抗体进行Western blot鉴定,获得突变型蛋白W168A、T172A、Q180A、K237A;圆二色谱分析结果显示,与野生型TIM（Wild type,wtTIM）相比,突变型TIM二级结构未发生明显变化;热稳定性和pH稳定性结果显示,在高温（60°C¹00°C）、强酸（pH 1.0⁵.0）、强碱（pH 10.0¹1.0）条件下均会有多聚物产生,突变型TIM比wtTIM更耐热,W168A与K237A对酸碱更敏感;免疫结合活性实验表明,与wtTIM相比,突变蛋白W168A与K237A的IgE结合活性显著下降约30%（p<0.05）;嗜碱性粒细胞激活实验进一步验证,突变蛋白W168A与K237A刺激细胞后,表面CD63和CD203c的相对表达量下降,但下降水平存在个体差异。综上所述,本研究解析了拟穴青蟹过敏原TIM的晶体结构,完成了不同物种间的结构比较及表位分析,明确了不同物种间TIM交叉反应的分子基础;通过分子改造获得低IgE结合活性的突变型TIM蛋白W168A及K237A,为蟹类过敏反应疾病分子诊断和免疫治疗提供了理论依据。