[目的]金黄色葡萄球菌是引起人类感染性疾病的主要病原菌,可分泌多种毒力因子,引起人体各个组织部位的感染,是血流感染最常见病原菌之一,近年来由于多重耐药菌的不断出现,尤其是hVISA和VISA的出现,给临床诊治带来极大的困难。本课题收集湖北省11家医院和中南地区(湖北省,湖南省和河南省)6家医院共768株金黄色葡萄球菌,分析其耐药性及分子流行病学特征,以便为临床抗感染治疗提供依据；采用PAP/AUC、MET和MHA5T三种方法检测1ⅥSA,旨在寻找出一种可用于临床检测hVISA经济、准确且简便易行的方法；建立小鼠败血症模型,检测小鼠体重、生存率、炎症反应、血液及组织细菌载量、组织病理学等变化,观察mgrA基因对小鼠败血症进程的影响,探讨金黄色葡萄球菌败血症的致病机制,为金黄色葡萄球菌败血症临床诊治提供新思路。[方法]一.金黄色葡萄球菌毒力基因检测及流行病学研究1.收集湖北省11家医院2010年5月1日至2010年12月31日分离的416株金黄色葡萄球菌及中南地区6家医院2011年6月1日至2012年5月31日分离的352株金黄色葡萄球菌并通过革兰染色、触酶试验、血浆凝固酶试验和PCR的方法重新鉴定,琼脂稀释法检测其对常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。2.采用多重PCR方法对MRSA菌株进行SCCmec、MLST、spa和agr分型,阳性标本进行测序并扩增分离自中南地区6家医院无菌体液标本中的金黄色葡萄球菌31个毒力基因。3.使用WHONET5.6软件分析药敏结果,其他数据统计采用SPSS18.0软件,以卡方检验或Fisher’s精确检验比较组间差异(P<0.05,表明差异具有统计学意义)。二、异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌检测方法及流行情况研究1.使用PAP/AUC、MET和MHA5T三种方法检测hVISA,并以PAP/AUC法作为金标准,比较MHA5T和MET法检测hVISA的敏感性及特异性。2.数据使用SPSS18.0软件进行统计,组间比较采用卡方检验或Fisher’s精确检验(P<0.05,表明差异具有统计学意义)。三、mgrA基因表达对金黄色葡萄球菌败血症进程的影响1.重叠延伸PCR+同源重组的方法敲除金黄色葡萄球菌Newman株mgrA基因。2.建立BALB/c小鼠败血症模型,实验分为两组,尾静脉分别注射野生型Newman株和mgrA基因敲除株,即Newman组和mgrA knockout组,分析mgrA基因对小鼠败血症进程的影响,实验分为四个部分：(1)注射6×106CFU菌落,每组10只BABL/c小鼠,监测至14天结束,比较两组小鼠生存率。(2)注射3×106CFU菌落,每组10只BABL/c小鼠,观察至14天,观察两组小鼠的体重变化。(3)注射6×106CFU菌落,每组每个时间点10只BABL/c小鼠监测至120h后结束,摘除眼球取血,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞,ELISA方法检测小鼠血清IL-6和TNF-a水平。(4)注射剂量：3×106CFU菌落,观察至14天结束。分析两组小鼠血液和组织(肝脏、脾脏和肾脏)细菌载量及组织病理学差异(H&E染色)。细胞因子水平、血液和组织细菌载量用mean±SD表示。3.所有数据均采用SPSS18.0软件进行分析,生存曲线分析使用Kaplan-Meier法,小鼠体重改变采用Manne-Whitney U-test法,细胞因子水平、血液和组织细菌载量结果用Student’s t-test进行分析,P<0.05具有统计学差异。[结果]一.金黄色葡萄球菌毒力基因检测及流行病学研究1.湖北省11家医院416株金黄色葡萄球菌共检出209株MRSA, MRSA检出率为50.2%。SCCmec分型分别为Ⅲ型,占82.8%(173/209)；Ⅳ型占13.4%(28/209)、Ⅱ型2.4%(5/209)和V型,占1.4%(3/209)。2.中南地区6家医院352株金黄色葡萄球菌共检出118株MRSA,检出率为33.5%。SCCmec分型主要为Ⅲ型,占80.5%(95/118),SCCmecⅣ型和Ⅱ型分别占8.5%(10/118)和5.1%(6/118)。agr分型分别为Ⅰ型,占81.4%(96/118),Ⅱ型,占15.3%(18/118),Ⅲ型,占1.7%(2/118),Ⅳ型占1.7%(2/118)。3.中南地区6家医院分离自无菌体液标本的184株金黄色葡萄球菌中MRSA流行率为41.8%(77/184)。MRSA和MSSA主要的流行克隆分别为ST239-SCCmecⅢ-t030-agr-I(43/77,占55.8%)和ST188-MSSA-tl89-agr-I(22/107,占20.6%)。4. MSSA菌株中pvl, tst, hlb, hlg-v, seb, sed和sei的流行率明显高于MRSA菌株(P<0.05),98株MSSA(53.3%)同时携带≥10个毒力基因,明显高于MRSA菌株(33.8%,26/77)(p=0.004),24株non-hVISA(40.0%)同时携带≥10个毒力基因,明显高于VISA菌株(11.8%,2/17)(P=0.041)。与其它CCs克隆相比,CC1和CC398克隆表皮剥脱素基因检出率更高(P<0.05),CC1和CC59克隆中pvl基因检出率更高(P<0.05)。二、异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌检测方法及流行情况研究1.与PAP/AUC法相比,MET法的敏感性和特异性分别为81.6%和92.4%,MHA5T法的敏感性和特异性分别为92.1%和62.6%。2.327株MRSA中共检出hVISA58株,hVISA流行率为17.7%。其中湖北省11家医院209株MRSA中有共检出hVISA38株,流行率为18.2%；中南地区6家医院118株MRSA中共检出hVISA20株,流行率为16.9%。3.58株hVISA的主要流行克隆为ST239-SCCmecⅢ-t030-agrI型,占84.5%(49/58)。耐药性监测发现hVISA对妥布霉素和左氧氟沙星的耐药率明显高于VSSA(P<0.05)。三、mgrA基因表达对金黄色葡萄球菌败血症进程的影响1.两组小鼠生存率和体重：Newman组有7只小鼠死亡(病死率70%),而mgrA knockout组仅有1只小鼠死亡(病死率10%),两组间病死率具有明显差异(logrank=4.739, P=0.029)。在两组小鼠分别注射3×106CFU剂量的细菌时监测发现,Newman组小鼠比mgrA knockout组体重下降更明显((P<0.05)。2.两组小鼠CD4+/CD8+T淋巴细胞比值和血清TNF-a, IL-6水平：CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在感染细菌24h达到高峰,在24h(P=0.0011)、8h(P=0.0025)和72h(P=0.0243)时,mgrAknockout组CD4+/CD8+T细胞比值明显低于Newman组。败血症诱导后12h血清IL-6水平达到峰值,之后迅速下降,4h(P<0.0001)、12h(P<0.0001)、24h(P<0.0001)、48h(P=0.0003)和72h(P=0.0012)时,Newman组的血清IL-6水平显著高于mgrA knockout组。血清TNF-a水平在败血症诱导后4h升至最高,Newman组明显高于mgrA knockout组(P=0.0032)。3.两组小鼠血液和组织细菌载量：Newman组小鼠肾脏和肝脏组织的细菌载量明显高于mgrA knockout组(Log10CFU/g肾脏7.53±0.23vs6.02±0.33, P<0.001; Log10CFU/g肝脏：5.82±0.26vs4.84±0.29,P=0.024)。两组小鼠脾脏细菌载量没有明显差异(Log1oCFU/g脾脏：4.67±0.19vs4.51±0.54,P=0.404)。4.组织病理学改变：在注射细菌后1d Newman组小鼠出现轻微的组织病理学改变,而mgrA knockout组没有发现明显改变。2d和4d时,两组小鼠肝脏和肾脏出现轻至中度病理学改变,脾脏出现轻微的病理学改变,脾脏体积明显增大。Newman组病理学改变明显比mgrA knockout组严重,7d时,两组小鼠均出现严重的病理学变化。[结论]1.中南地区分离自无菌体液标本中的MRSA菌株,主要流行克隆为ST239-MRSA-SCCmecⅢ-t030-agrⅠ型,占55.8%,表明本地区存在耐药株的传播,医疗部门应采取有效的措施控制耐药克隆的传播,如加强手部卫生、隔离患者、严格注意无菌操作、加强医院环境卫生等。2.湖北省11家医院及中南地区6家医院768株金黄色葡萄球菌中hVISA流行率达17.7%。因hVISA主要由糖肽类药物选择性压力产生,故临床应重视合理使用抗生素。3. PAP/AUC法是目前检测hVISA最准确的方法,但由于操作较为繁琐,难以应用于临床,MHA5T法检测hVISA的敏感性高达92.1%,推荐其可用于临床hVISA的初筛,初筛阳性的标本可再使用PAP/AUC法进行确证,以减少工作量和E-test实验条的使用。4. mgrA基因在金黄色葡萄球菌败血症进程中发挥重要作用,在小鼠败血症模型中,mgrA可增加小鼠的死亡率,加剧败血症的发生和发展,与mgrA knockout组相比,Newman组小鼠具有更激烈的炎症反应,更多的血液和组织细菌载量和更严重的组织病理学变化, mgrA基因表达有助于金黄色葡萄球菌逃避宿主巨噬细胞的吞噬及杀伤,粘附至组织引起更严重的疾病,加剧败血症的发生和发展。