论文部分内容阅读
牛巴氏杆菌病又称为牛出血性败血症,是由多杀性巴氏杆菌感染引起的一种急性传染病,急性型呈出血性败血症迅速死亡;慢性病例的病变多限于局部器官,通常表现为皮下结缔组织、关节、脏器的化脓性病灶。目前用于预防牛多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要为强毒株的灭活菌苗,弱毒活菌疫苗和亚单位疫苗,由于传统的细菌全菌体灭活疫苗的免疫效果不理想,不能提供较强的保护力,弱毒活菌疫苗由于其本身存在活的多杀性巴氏杆菌,在宿主动物机体中存在毒力返强的风险。因此研制一种安全有效的疫苗对控制牛巴氏杆菌病具有重要意义。本试验以pHH43质粒为模板,通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E,再将裂解盒插入到pPBA1100载体中,构建裂解质粒pPBA1100-E。利用电转化的方法将其转入牛多杀性巴氏杆菌中,将含有裂解质粒的牛多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD600nm值约为0.4时,将培养温度升至42℃进行诱导,制备牛多杀性巴氏杆菌菌影,分别计算诱导前细菌数和诱导后细菌数计算裂解效率,其裂解效率可达99.997%。经电镜观察发现裂解后的细菌保留了细菌的基本形态结构,内容物几乎全部释放到菌体外,仅留下细菌空壳,在菌体中间可见明显的孔洞。应用制备的菌影疫苗对小鼠进行免疫接种,分析菌影疫苗对小鼠的免疫效力。将100只5周龄的雌性BALB/c小白鼠,随机分成4组:菌影组、菌影+佐剂组、灭活苗组和PBS对照组,每组25只,实验室适应1周后,间隔两周连续接种两次。在免疫前采血分离血清做阴性血清,在一免2周后,二免2周后采血分离血清利用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体的水平,同时使用细胞因子检测试剂盒检测二免两周后各组小鼠血清中IL-4、和IFN-γ的含量;然后从二免后3周开始连续数周采集血液,每次间隔一周,检测小鼠血清中IgG抗体的消长趋势。每次免疫两周后每组处死5只小白鼠,无菌取出脾脏,从脾脏中分离淋巴细胞,检测免疫后CD4+和CD8+T淋巴细胞的动态变化。在二免2周后用牛多杀性巴氏杆菌对小鼠进行攻毒,攻毒后记录小鼠的存活率。从体液以及细胞免疫水平对牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的免疫效力进行分析。试验结果显示,本试验制备的牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,可为小鼠抵抗牛多杀性巴氏杆菌的攻击提供较高的保护力。本试验为进一步研究牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。