近年来,肿瘤的发病率和致死率逐年增加,已成为危害当今人类生命和生活质量的重大疾病之一。虽然药物化疗是目前临床上治疗肿瘤的重要手段,却存在着无选择性杀伤正常细胞和肿瘤细胞的治疗屏障。纳米聚合物载药系统能够增加对肿瘤细胞的选择性,减少其在非靶向部位的聚集,延长药物在体内的作用时间,是目前提高化疗药物疗效,减少不良反应的有效途径之一。氨基酸类聚合物是美国FDA所批准的生物医用材料之一,具有良好的生物相容性和生物可降解性,在体内环境下能够降解为无毒性的物质,并最终排出体外。此外,氨基酸本身具有多个活性基团点位,不论是氨基酸的均聚、共聚或其他聚合物,它都保留着某些活性基团,这些基团为材料的功能化和可修饰性提供了条件。因此生物友好的氨基酸类聚合物已成为生物医用材料领域新兴的研究热点,特别是近年来在给药系统的研究中引人关注。1.目的鉴于氨基酸类聚合物在给药系统中表现出的优良性能,本文以L-色氨酸(L-Trp)为原料,制备N-丙烯酰化-L-色氨酸(A-Trp)。再以A-Trp为功能单体,采用沉淀聚合法制备L-色氨酸纳米聚合物(NPs)。该纳米聚合物具有较好的细胞相容性和生物可降解性,对模型药物硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate,VCR)、硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate,VBL)和酒石酸长春瑞宾(Navelbine Ditartrate,NVB)有良好的载药及释药性能,可作为这一类抗肿瘤药物的通用新型载体,实现该类药物在体内的传递与控制释放。2.内容2.1 制备功能单体N-丙烯酰化-L-色氨酸(A-Trp),并对所制备的A-Trp进行结构确证。2.2 以A-Trp为功能单体制备L-色氨酸纳米聚合物(NPs),并以吸附量为指标,对NPs的制备工艺条件进行优化。2.3 对优化工艺条件下制备的NPs进行结构表征;并考察NPs对模型药物硫酸长春新碱、硫酸长春碱和酒石酸长春瑞宾的载药性能及体外释药性能。2.4 考察NPs的生物可降解性和细胞毒性。3.方法3.1功能单体N-丙烯酰化-L-色氨酸的合成及表征(1)以L-色氨酸(L-Trp)为原料,丙烯酰氯为酰化试剂,在碱性条件下对L-Trp的伯胺基进行丙烯酰化修饰,制备功能单体N-丙烯酰化-L-色氨酸(A-Trp)。(2)借助元素分析、质谱、核磁共振谱和红外光谱等对所制备的A-Trp进行结构确证。3.2 L-色氨酸纳米聚合物的制备及优化(1)以A-Trp为功能单体,采用本体聚合和沉淀聚合两种不同的聚合法泡制备L-色氨酸聚合物,通过L-色氨酸聚合物对VCR吸附量的比较,确定制备L-色氨酸聚合物的方法。(2)采用单因素考察和均匀设计法,以L-色氨酸纳米聚合物(NPs)对VCR的吸附量为指标,对沉淀聚合法中影响该聚合反应过程的参数,包括功能单体A-Trp的用量、交联剂EDMA的用量、溶剂DMF的用量和聚合反应温度等,进行优化。3.3 L-色氨酸纳米集合物的表征及其载药、体外释药性能研究(1)采用扫描电镜、粒度分析、红外光谱等手段对优化工艺条件下制备的NPs的形貌及结构进行表征。(2)采用吸附法,以长春新碱(VCR)、长春碱(VBL)和长春瑞滨(NVB)为模型药物,考察吸附时间、药物浓度及药物结构对载药量及包封率的影响。(3)通过累积释药百分率,考察载药纳米粒VCR-NPs、VBL-NPs和NVB-NPs的在释放介质磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)中的释药行为,并用模型方程进行拟合。3.4 L-色氨酸纳米聚合物的生物可降解及细胞毒性评价(1)采用动态渗析法,通过测定降解后NPs的重量损失百分比,考察NPs在PBS中的生物可降解性。(2)以小鼠成纤维L-929细胞株和人乳腺癌MCF-7细胞株为研究对象,通过细胞形态观察和MTT法测定各个细胞的相对增殖率(Relative Growth Rate,RGR),考察NPs以及VCR-NPs的细胞毒性。4结果4.1功能单体N-丙烯酰化-L-色氨酸的合成(1)L-Trp的伯胺基通过酰化反应,引入丙烯酰基,制备了功能单体A-Trp。所制备的A-Trp呈白色粉末状固体,产率约为52.4%(3.25g),熔点在164～165℃之间,薄层色谱显示一个圆斑点。(2)在A-Trp的1H-NMR和13C-NMR图谱中出现了丙烯酰基的质子和碳原子信号;与L-Trp相比,A-Trp的红外光谱亦增加了 uc=O1650 cm-1处酰胺羰基伸缩振动吸收峰和uN-H 3353 cm-1处酰胺基上仲胺的伸缩振动吸收峰;A-Trp的C、H、N元素含量的实测值与其理论计算值非常接近,质谱易证明所制备的化合物分子式及列解碎片与目标化合物A-Trp相符,以上结果表明所得产物为A-Trp。4.2 L-色氨酸纳米聚合物的制备及优化(1)以A-Trp为功能单体采用本体聚合法和沉淀聚合法制备L-Trp聚合物,所制备的聚合物对模型药物VCR的吸附量分别是33.03μmol/g和55.14μmol/g。根据吸附量的大小,确定采用沉淀聚合法制备NPs。(2)通过单因素考察,确定了沉淀聚合法合成NPs主要影响因素及影响范围:功能单体A-Trp的用量,0.2～2.0mmol;交联剂EDMA的用量,0.4～4.0mmol;溶剂DMF的用量,25～45mL;引发温度,45～65℃。通过均匀设计法对各因素水平进行了优化拟合,并以吸附量为指标,确定了沉淀聚合法制备NPs的最优工艺:功能单体A-Trp的用量:1.78mmol;交联剂EDMA的用量:2.83mmol;溶剂DMF的用量:30mL;引发温度:55℃。按此优化条件制备的NPs对VCR的吸附量为92.62μmol/g。4.3 L-色氨酸纳米聚合物的表征以及其载药、体外释药性能研究;(1)优化工艺条件下制备的NPs表面光滑、平整,平均粒径为169.3 nm。在NPs的IR中明显看到1600cm-1附近的uC=C伸缩振动吸收峰已不明显,说明功能单体A-Trp以及交联剂EDMA中的双键均已发生了聚合反应。此外,在IR中还能观察到uc=O 1730cm-1处酯键和羧酸上羰基的伸缩振动吸收峰,uC=O1659cm-1处酰胺羰基的伸缩振动吸收峰,uc-O-c1256 cm-1、1155 cm-1处酯基碳氧单键的伸缩振动吸收峰以及δ C-H 750 cm-1处A-Trp的邻-二取代芳环不饱和碳氢的面外弯曲振动吸收峰等。(2)载药实验表明,制备的NPs对药物的载药量受到药物浓度、吸附时间、模型药物的结构等影响。NPs对模型药物VCR的载药量随VCR的浓度增加而增加,当VCR的浓度为0.6mmol/L时达到最大;NPs对模型药物VCR的吸附时间为8h时基本达到吸附平衡,载药量达到最大;NPs对VCR、VBL及NVB的包封率分别为:65.99%、48.49%和47.25%;载药量分别为:8.55%,7.04%和6.72%。(3)体外释药实验结果表明,在释放条件下,连续观察144h,载药纳米粒VCR-NPs、VBL-NPs和NVB-NPs的累积释药百分率都超过95%,证明载药纳米粒在释放介质中,药物释放缓慢、完全。经过方程拟合发现载药纳米粒VCR-NPs的体外释药曲线符合Retger-peppas方程。4.4 L-色氨酸纳米聚合物的生物可降解性及细胞毒性评价(1)NPs在PBS介质中具有一定的降解性。在前30天,L-色氨酸纳米聚(1)NPs在PBS介质中具有一定的降解性。在前30天,L-色氨酸纳米聚合物的重量损失百分比为16.30%。(2)通过细胞形态观察发现,与NPs共孵育的小鼠成纤维L-929细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的细胞形态与空白对照组的细胞形态没有明显的区别。对NPs进行细胞毒性试验发现,小鼠成纤维L-929细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的相对增殖率(RGR)均高于90%。与MCF-7细胞共孵育24h,VCR-NPs和VCR对MCF-7细胞增殖的抑制作用都随着浓度的增加而增大。当VCR的相当浓度为10000ng/mL时,VCR-NPs和VCR对MCF-7细胞的抑制率分别为60.70%和36.86%。5 结论5.1通过酰化反应制备所得的A-Trp为白色粉末状,产率约为52.4%(3.25g),熔点在164～165℃之间。其结构经元素分析、质谱、核磁共振谱和红外光谱得到了确证。5.2选用沉淀聚合法制备NPs,以吸附量为指标,结合单因素考察和均匀设计法优化了沉淀聚合法制备NPs的工艺参数并确定了最优制备工艺条件:功能单体A-Trp的用量:1.78mmol;交联剂EDMA的用量:2.83mmol;溶剂DMF的用量:30mL;引发温度:55℃。最优工艺制得的NPs平均粒径为169.3nm,对VCR的吸附量为92.62μmol/g。5.3优化工艺条件下制备的NPs对VCR的包封率和载药量最高(65.99%和8.55%),其次是 VBL(48.49%和 7.04%),最小是 NVB(47.25%和 6.72%),说明本研究制备的NPs对VCR及其结构类似物VBL、NVB等都具有一定的载药性能,推测模型药物与NPs之间所发生的π-π作用可能是NPs对长春碱类药物具有良好载药性能的主要作用力。可作为这一类抗肿瘤药物的通用载体,实现该类药物在体内的传递与控制释放。5.4载药纳米粒在释放介质PBS中,药物释放缓慢、完全,载药纳米粒VCR-NPs、VBL-NPs和NVB-NPs在144h的累积释药百分率都超过95%。VCR-NPs的体外释药曲线符合Retger-peppas方程,证明VCR-NPs在PBS中的释放过程受扩散作用和纳米载体与药物之间非共价键作用以及纳米聚合物本身的降解的共同影响。5.5体外降解实验发现,NPs在介质PBS中具有一定的生物可降解性。5.6细胞毒性实验发现,NPs对小鼠成纤维L-929细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的形态、正常生长均无明显影响,为1级低毒材料。原料药VCR和载药纳米粒VCR-NPs与MCF-7细胞共培养24h后,两组药物对MCF-7细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性,但VCR-NPs的细胞抑制率低于原料药VCR。可能是NPs通过π-π、静电、氢键等相互作用吸附、包载药物,药物释放缓慢,在共培养24h时VCR从载体中没有完全释放,因而对MCF-7细胞的抑制率较原料药VCR 低。