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青叶胆青叶胆(Swertia mileensis T.N.Ho et W.L.Shi)为龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属(Swertia.)多枝组一年生草本植物,具有清热解毒、利胆健胃的功效,是我国特有的一种珍稀药材。由于近20年的滥采滥挖,分布区域已渐成“岛屿状”,片断化明显,趋于濒危状态。然而,长期以来,国内外学者对青叶胆的研究主要集中在其化学成分及药理活性上,而生物学方面的研究则相对匮乏。本研究拟运用繁殖生物学和分子生物学的原理及方法,对特有区域药用植物青叶胆进行研究。研究结果概括如下:1、通过野外调查,掌握了青叶胆的开花物候,跟踪拍摄了青叶胆整个开花动态过程,观察到青叶胆单花开放时长为5~6 d,群体花期在9~10月。2、以植株高度、个体分枝数、叶片长度、花梗长度和子房长度作为形态指标,对云南弥勒5个青叶胆自然居群的变异式样进行研究发现,5个形态指标在各居群间均有极显著性差异(P<0.01);形态变异最大的是个体分枝数,其次是花梗长度、叶片长度和植株高度,最小的是子房长度。用单因素和LSD多重比较对5个性状在居群间的差异进行了分析。3、目前对青叶胆繁育特性研究甚少。通过野外定点观察,运用TTC法、联苯胺-过氧化氢法、花粉-胚珠比(P/O)、杂交指数、繁育系统检测等方法,对其传粉生物学进行了观察和实验。结果表明,青叶胆雄蕊比雌蕊早熟24 h左右,单花花粉活力持续时间36-48 h,和柱头可授期之间具10-12 h的重叠期。P/O值为1918.63±1053.56,杂交指数OCI=5,暗示青叶胆繁育系统属于异交,部分自交亲和,需要传粉者。然而与花综合特征所暗示的繁育系统类型不尽相同,连续2年的野外观察发现昆虫的访花频率不高,同株人工异花授粉套袋结籽率为68.37%,整个植株不去雄并套袋亦有42.13%的结籽率,说明青叶胆有较高的自交亲和性。尽管利用花粉活力评价的传粉效率从散粉30 h后开始下降,但随着花部的发育,雄蕊由正对雌蕊转为背对雌蕊且偏离雌蕊30-45o,轻微的振动可使同株花序单花花粉由上而下传递。青叶胆的这种同株异花授粉亲和性应属于延迟自交类型。同株异花授粉发生在聚伞花序的上下单花之间,在此之前每一单花仍保持异交传粉机制,这种延迟自交机制和较高的自交亲合性为青叶胆在恶劣生境下由于访花昆虫缺乏造成的异交失败提供了繁殖保障,同时显示青叶胆具有一定的适应生境片断化及环境干扰的潜力。此外,不同种群间人工异花授粉结籽率远高于同一种群的自然传粉结籽率,说明青叶胆片断化种群的有性生殖系统受到花粉限制和缺少访花昆虫的影响。4、以青叶胆叶片为材料,采用改良CTAB法提取DNA,通过单因素筛选法及L16(45)正交实验对影响青叶胆EST-SSR PCR的各因子进行优化试验,探讨了青叶胆EST-SSR反应体系的优化实验,建立了青叶胆EST-SSR最佳反应体系,并在此基础上对其引物进行了初步筛选。结果表明青叶胆EST-SSR的最佳反应体系为(20μL):50 ng模板DNA,150μmol/L d NTPs,0.1μmol/L引物,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.5μmol/L Mg2+。同时从60对青叶胆引物中初步筛选出10对条带清晰、多态性好的引物。