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目的为了探究i NKT细胞对类风湿关节炎(RA)免疫平衡状态的影响,我们构建了RA小鼠模型,检测iNKT细胞频率,Th1/Th2/Th17亚群和细胞因子。并在体外诱导胸腺淋巴细胞向iNKT细胞分化,过继输注细胞至RA小鼠,探究iNKT细胞对RA小鼠的干预作用;对Th1/Th2/Th17免疫失衡的影响;并探讨iNKT细胞对RA的影响机制,为今后RA发病机制和治疗方法的探究提供新的理论依据。方法1.构建类风湿关节炎小鼠模型及鉴定hGPI325-339、hGPI469–483多肽片段1:1混合,与完全弗氏佐剂充分乳化后,于DBA/1小鼠尾根部多点皮下注射,百日咳毒素0 h、48 h腹腔注射加强免疫进行造模。以健康小鼠为对照,观察小鼠体重变化、足踝关节红肿情况;足踝关节苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察炎细胞浸润情况;流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测外周血、脾脏iNKT细胞频率和Th1/Th2/Th17亚群比率,微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测血清细胞因子IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6的水平变化。2.胸腺来源的i NKT细胞的诱导及免疫生物学功能检测分离DBA/1小鼠胸腺,获取淋巴细胞悬液,添加IL-2、IL-4、α-GalCer,体外刺激诱导i NKT细胞。一周后,免疫磁珠分选技术(Magnetic Cell Sorting,MACS)分离iNKT细胞,FACS检测iNKT细胞频率、细胞亚群情况,CBA法检测培养上清中细胞因子水平。用细胞膜深红色荧光探针(Di R)染色细胞,尾静脉过继输注至正常小鼠,小动物活体成像系统观察细胞分布,并对小鼠体重、皮毛、皮肤、活动和姿势进行评价,确定其输注的安全性。3.观察胸腺来源的i NKT细胞对RA小鼠的Th1/Th2/Th17的影响应用胸腺来源的i NKT细胞对RA模型小鼠进行干预,以α-GalCer作为阳性对照,观察各组小鼠体重变化和足踝关节肿胀变化情况;关节组织HE染色法观察炎细胞浸润情况的变化;FACS检测i NKT细胞频率和细胞亚群变化,CBA法检测各组小鼠各期血清中细胞因子水平变化。结果1.RA模型小鼠较健康对照组体重增长缓慢(P<0.05);RA模型小鼠在造模第7天,足趾最先出现红肿,在造模第14天红肿达到高峰,后逐渐缓解;HE观察发现足踝关节有大量炎细胞浸润。炎症高峰期i NKT细胞频率下降明显(P<0.05);炎症早期Th1和Th17亚群上升明显(P<0.05),炎症中后期Th2亚群上升明显(P<0.05);炎症高峰期血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6水平显著升高(P<0.05);RA小鼠iNKT频率与TNF-α、IL-6、Th1亚群水平呈负相关。2.胸腺淋巴细胞以CD4+CD8+细胞为主,体外刺激诱导一周后,iNKT细胞频率为7.07%±1.12%,经纯化后频率为63.37%±5.84%。分离后的细胞以Th2细胞为主,受刺激后主要分泌IL-4。细胞输注至正常小鼠后多分布在肝脏、脾脏,小鼠各项评分正常。3.α-GalCer和细胞输注均可显著改善RA模型小鼠体重增长缓慢、关节肿胀情况(P<0.05);足踝关节炎细胞浸润减少;iNKT细胞频率上升;Th1/Th2/Th17亚群及细胞因子紊乱现象得到一定纠正。结论1.GPI混合肽段诱导的RA模型小鼠在iNKT细胞和Th1/Th2/Th17细胞免疫病理方面与RA患者较为接近,可作为RA免疫机制研究和治疗的良好工具。2.胸腺双阳性T细胞可体外诱导为iNKT细胞,为i NKT细胞发育的研究及以i NKT为中心的细胞疗法的建立提供了参考。3.细胞输注通过纠正RA小鼠体内Th1/Th2Th17亚群及细胞因子免疫平衡紊乱,维持免疫耐受,发挥免疫调节功能,具有潜在的临床应用价值。