本文针对目前病毒样颗粒(Virus-like particles.VLPs)研究中的一个热点——内含特定RNA的MS2VLPs的原核和真核表达及应用研究两个重要问题进行探讨，共由两部分研究组成。　　 手足口病(hand foot and mouth disease.HFMD)是由肠道病毒感染导致的临床症候群，是全球性传染病，全世界大部分地区均有该病流行的文献报道。肠道71型病毒(enterovirus 71，EV71)与柯萨奇16型病毒(coxsackievirus A16.CA16)感染交替出现，成为HFMD的主要病原体。目前广泛用于手足口病毒(hand foot and mouth virus.HFMV)核酸检测的质控品和标准品多为质粒、灭活病毒、经特殊处理的RNA和患者阳性血清。它们具有易被核糖核酸酶(ribonulcease，RNase)降解、具有生物传染危险性、稳定性较差和异质性等缺点。因此，我们应用传统的MS2噬菌体克隆程序，表达一种耐RNase的内嵌肠道病毒RNA通用片段和HFMVRNA片段的嵌合型MS2VLPs，作为肠道病毒和HFMV核酸检测的新型质控品和标准品。笫一部分旨在研究内含HFMVRNA的MS2VLPs的原核表达及其作为病毒核酸检测室间质量评价样本的应用研究。本研究构建了包含了三段靶序列（EV71-VLPs和EV-VLPs靶序列均来自EV71病毒，CA16-VLPs靶序列来自CA16病毒，其中EV-VLPs靶序列为肠道病毒通用序列）的三个VLPs，这些VLPs经过稳定性和安全性等一系列的特征鉴定和验证后，用国际标准品予以赋值，并且将其应用于评价各实验室检测EV71和CA16病毒核酸的室间质量评价(External quality assessment，EQA)。EQA血清盘由20个样本组成，包括由不同浓度EV-VLPs和不同浓度的EV71-VLPs或CA16-VLPs的组合成的14份阳性标本，2份这三种VLPs组成的模拟EV71和CA16混合感染标本，和4份阴性样本。这20份标本（内附指导说明）通过快递常温运送至全国54个负责HFMV分子检测的网络实验室，要求其在规定的时间内，采用其实验室常规检测所用的方法进行检测后，按要求回报结果。　　 研究结果表明，我们通过分子克隆和原核表达方法，成功构建了表达内含HFMVRNA的三个VLPs，VLPs经过一系列特征验证，具有耐RNA酶、无生物传染危险性、稳定性好等优点。这些VLPs作为病毒替代物首次应用于全国HFMV检测的EQA。我们共收到来自41个参与实验室的41份反馈检测报告，结果表明87.8％(36/41)实验室使用的是商品检测试剂盒（real-time RT-PCR法），用室内自配RT-PCR(in-house RT-PCR法)试剂的实验室只有12.2%(5/41)。各实验室的检测结果差异较大，仅31.7%(13/41)实验室的检测结果与预期结果完全相符（100分），29.3%(12/41)的实验室检测能力有待进一步提高（＜90分）。23个实验室报告了假阴性结果，其假阴性率为7.3%(101／1.394)，EV71的检测敏感性(82.1%)明显低于EV(97.4%)或CA16(95.1%)(P＜0.05)。因此，本研究表达的VLPs完全可以替代病毒作为室间质量评价的样本，全国HFMV分子检测的网络实验室在HFMV分子诊断方面有较为明显的不足之处，如一些商业试剂盒的低敏感性和个别参与实验室的低检测能力。因此，EQA应该作为一项长期的工作被定期严格执行，以帮助监测实验室在HFMV的检测能力和提高来自不同实验室结果的一致性，使之具有可比性。另外，由于RNA病毒的易突变性，在以后的EQA样本中还应该增加HFMV更多的基因型。　　 用RNA替代DNA作为基因疫苗是近年来研究的热点和趋势，因为RNA不会整合到宿主细胞基因组，也不会引起自身免疫病等严重的副作用。当前mRNA疫苗的研究主要集中在治疗性肿瘤疫苗和免疫治疗的研究。酿酒酵母细胞表达的包装外源功能性mRNA的MS2VLPs具有使RNA稳定、高体内转运效率和安全的特性。本课题的前期研究已经证明，基于MS2噬菌体衣壳蛋白的VLPs可作为mRNA新型递送载体，免疫小鼠后可诱导针对编码该mRNA表达蛋白的特异性抗体的产生。因此，本项研究采用酿酒酵母表达系统获得重组MS2VLPs作为肿瘤治疗性mRNA疫苗的新型递送载体，MS2VLPs内装载有肿瘤相关抗原如癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)编码mRNA(CEA-RNA)。建立小鼠结肠癌动物模型和转CEA基因动物模型，来研究其诱导的免疫效果和免疫保护能力。第二部分旨在研究内含癌胚抗原(CEA)-mRNA的MS2VLPs的真核表达及其作为结直肠癌治疗性疫苗的研究。本研究将编码CEA蛋白的cDNA序列插入pMS2构建能包装CEA mRNA的pMS2-CEAVLPs的表达载体。经测序鉴定正确后，转化到酿酒酵母YPH499细胞内，并进一步诱导表达MS2 VLps。纯化后，采用琼脂糖凝胶电泳和电子显微镜鉴定，并对上述VLPs进行RT-PCR扩增，以验证VLPs是否包装了全长的CEA-RNA。提取pMS2-CEA VLPs包装的RNA，使用DOTAP转染试剂转染至哺乳动物细胞，使用Western Blot法检测CEA蛋白的表达，同时计算pMS2-CEA VLPs诱导的效应细胞对MC38-CEA细胞的杀伤率。取50μg纯化的pMS2-CEA VLPs，免疫6-8周C57BL/6小鼠和结直肠癌模型小鼠。三次免疫后取小鼠尾静脉血用ELISA法检测抗原特异性抗体的产生和用ELISPOT法检测细胞免疫应答水平(IFN-γ)以及观察荷瘤小鼠的生存时间。　　 研究结果表明，采用单质粒表达系统，在酿酒酵母YPH499细胞内MS2衣壳蛋白成功的包装了CEA mRNA，形成了MS2-CEA VLPs。提取RNA转染哺乳动物细胞（MC38细胞和CHO细胞）后可检测到目的蛋白的表达；在效靶比为20∶1和40∶1时，pMS2-CEA VLPs诱导的效应细胞对MC38-CEA细胞的杀伤率分别为38.7%和43.6%，而对MC38细胞的无明显杀伤作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。我们还进一步证实了纯化后的pMS2-CEA VLPs免疫C57BL／6小鼠后，可以诱导抗原特异性体液和细胞免疫应答，并对荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用。另外观察肿瘤组小鼠的生存时间发现，免疫组小鼠的生存时间明显延长。综上所述，本研究成功构建了MS2 VLPs的酿酒酵母表达载体pMS2-CEA，并证实酿酒酵母细胞表达系统可成功地表达MS2 VLPs。同时也证明了酿酒酵母细胞表达的MS2 VLPs可作为mRNA的新型递送载体，可以诱导抗原特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，对荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤怍用，能明显延长荷瘤小鼠的生存时间。