论文部分内容阅读
ROP9为拟南芥小GTP蛋白ROPs家族中的第二亚家族中的成员,它作为ABA（脱落酸）反应中的负调节因子,影响着ABA对种子萌发及根生长的抑制作用。而ABI2作为蛋白磷酸酶中的一员,对ABA反应也起着负调控作用。本实验室前期在对ABI2相互作用蛋白的筛库工作中发现ROP9可能与ABI2相互作用。通过分析ROP9与ABI2互作在ABA信号通路中的功能,为揭示ABA信号途径精细的分子机制提供了一定的帮助,对植物抗逆研究具有十分重要的意义。本论文利用酵母双杂交系统对ROP9与ABI2的相互作用进行了进一步的验证,并且通过对ROP9的定点突变,构建了持续激活态的CA-ROP9以及持续失活态的DN-ROP9,将其应用于酵母双杂交系统中。通过对结果的分析发现,正常态的ROP9以及激活态的CA-ROP9能够与ABI2产生相互作用,而失活态的不能与ABI2相互作用。这表明ROP9是以激活的形式与ABI2相互作用的。为了进一步验证ROP9与ABI2在拟南芥细胞内是否也具有相互作用,利用了双分子荧光互补技术对其进行分析,结果证明两者在拟南芥细胞内同样也存在相互作用,并且发现这一相互作用是发生在细胞膜上的。利用农杆菌介导的转基因技术获得了ROP9pro-GUS转基因拟南芥植株。对其进行组织化学染色分析,发现ROP9主要在根尖,柱头,花托以及维管系统中表达,而在气孔中没有发现ROP9的表达。构建ROP9的RNA干扰植株,得到了三个株系。半定量分析结果表明,在这三个株系的RNA干扰植物中,ROP9的表达水平出现了不同程度的下调。表明三个株系的拟南芥植株均为ROP9的RNA干扰植株。对ROP9的T-DNA（?）入突变体salk111788的植株进行了鉴定,并获得了纯合的突变植株。但通过半定量分析发现其中ROP9的表达水平并未降低,反而与野生型相比有所升高,因此说明其不是有效的ROP9的T-DNA插入突变体。还利用拟南芥转基因技术将ROP9-pEGAD导入植株中,获得了ROP9的过表达转基因植株,并利用半定量分析确定了ROP9过表达植株中ROP9表达水平发生了上调。将ROP9的RNAi转基因植株与过表达植株,种植于含有ABA的MS上,观察其萌发率及生长状态。发现在ABA的处理下,ROP9的RNAi转基因植株的萌发率要明显低于野生型,而过表达植株的萌发率要高于野生型；而未处理下,ROP9RNAi转基因植株与过表达植株的萌发率与野生型没有明显的差别。同时通过原核表达出ROP9、CA-ROP9. DN-ROP9与ABI2蛋白,并进行纯化。将这些蛋白与ABI2一起孵育,然后进行磷酸酶活性的测定,发现正常态的ROP9与激活的CA-ROP9对ABI2的磷酸酶活性具有显著的激活作用。综合上述结果,说明ROP9通过激活ABI2的磷酸酶活性与ABI2相互作用,并在ABA信号途径中起负调控的作用。