论文部分内容阅读
第一部分食管鳞癌顺铂耐药细胞的建立和长链非编码RNA NORAD的表达目的:通过建立食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)顺铂(cis-dichloro diammine platinum,CDDP)耐药细胞株,检测长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)DNA损伤激活的RNA(Non-coding RNA activated by DNA damage,NORAD)在ESCC CDDP耐药前后表达水平的变化,为深入研究食管癌CDDP耐药机制奠定基础。方法:通过体外间歇诱导和药物浓度递增的方法建立可在一定浓度CDDP培养液中维持生长的CDDP耐药细胞株YES-2/CDDP-R。倒置显微镜观察细胞形态学变化。MTT检测YES-2和YES-2/CDDP-R细胞CDDP的半抑制浓度。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blotting)检测YES-2和YES-2/CDDP-R细胞中多耐药相关蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1)表达情况。细胞划痕愈合实验检测YES-2和YES-2/CDDP-R细胞迁移能力。q RT-PCR检测YES-2和YES-2/CDDP-R细胞中NORAD表达情况。结果:CDDP浓度梯度处理9个月后,建立食管癌CDDP耐药细胞株YES-2/CDDP-R。倒置显微镜下观察YES-2/CDDP-R细胞膜边界不清,细胞核折光度降低,细胞内空泡及黑色颗粒明显增多,出现巨大细胞。YES-2细胞CDDP耐药后较亲本细胞CDDP的IC50值显著升高(P<0.05),细胞的耐药指数(resistance index,RI)为2.16。YES-2/CDDP-R细胞较YES-2细胞MRP1的表达水平升高(P<0.05)、细胞迁移能力升高(P<0.05)、NORAD表达水平升高(P<0.05)。结论:1.成功建立食管癌YES-2细胞CDDP耐药细胞株YES-2/CDDP-R,细胞耐药后对CDDP敏感程度降低、MRP1表达上调、迁移能力增强。2.YES-2/CDDP-R细胞较亲本细胞NORAD表达升高。第二部分长链非编码RNA NORAD通过靶向miR-101-3p调控食管鳞状细胞癌顺铂耐药目的:分析NORAD在顺铂耐药细胞YES-2/CDDP-R中的表达及其对细胞生物学行为的影响。通过数据库检索预测NORAD可能作用的下游信号分子,探讨NORAD通过微小RNA(micro RNA,miRNA)影响食管癌YES-2细胞顺铂耐药机制。方法:通过脂质体转染法用lnc RNA NORAD的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)敲低食管癌CDDP耐药细胞株YES-2/CDDP-R中NORAD的表达。设置分组为(Con组、si-NORAD-1组、si-NORAD-2组和si-NORAD-3组),使用q RT-PCR检测NORAD敲除效率。YES-2/CDDP-R细胞NORAD敲低后,MTT检测细胞增殖能力变化,细胞划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化,Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化。DIANA-Lnc Base v.2数据库查询NORAD下游可能作用靶点。q RT-PCR法检测NORAD敲低前后YES-2/CDDP-R细胞的miR-101-3p表达情况。Target Scan数据库检索miR-101-3p下游可能作用靶点。Western blotting检测NORAD与miR-101-3p共同敲低后YES-2/CDDP-R细胞中MRP1蛋白表达情况。MTT检测NORAD与miR-101-3p共同敲低后YES-2/CDDP-R细胞对CDDP的耐受程度。结果:通过q RT-PCR检测结果示si-NORAD组较Con组NORAD表达水平均降低(P<0.05或P<0.01)。NORAD在YES-2/CDDP-R细胞中敲低后,细胞增殖能力降低(P<0.05),细胞迁移能力降低(P<0.05),细胞侵袭能力降低(P<0.05)。DIANA-Lnc Base v.2数据库检索发现NORAD含有7个与miR-101-3p的预测结合位点,说明miR-101-3p可能是NORAD的下游靶基因。q RT-PCR结果示,YES-2/CDDP-R细胞较亲本细胞miR-101-3p表达下调(P<0.05);si-NORAD较Con组miR-101-3p表达上调(P<0.05)。Target Scan数据库检索发现miR-101-3p与MRP1的3’UTR端存在结合位点,说明miR-101-3p可能对MRP1转录后调控发挥作用。Western blotting结果示,si-NORAD组较Con组MRP1蛋白表达显著降低(P<0.05)。si-NORAD+miR-101-3p inhibitor组较si-NORAD组MRP1蛋白表达升高(P<0.05)。MTT检测结果示,si-NORAD组较YES-2/CDDP-R组IC50值下降(P<0.05);但si-NORAD+miR-101-3p inhibitor组较si-NORAD组IC50值升高(P<0.05)。结论:1.NORAD影响食管癌CDDP耐药细胞株YES-2/CDDP-R的细胞增殖、迁移和侵袭生物学行为。2.NORAD通过miR-101-3p/MRP1调控YES-2细胞CDDP耐药。