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背景与目的:肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种累及脑与脊髓上下运动神经元,以进行性和选择性损伤运动神经元为主要特点的致死性神经变性病。起病隐匿,患者常在3-5年内因呼吸肌麻痹而致死,预后很差,而且目前无针对其特异性的诊断和治疗方法。目前,力鲁唑是由美国FDA批准的目前唯一在人群中得到证实对肌萎缩侧索硬化症有效的药物,但也只能延缓2-3月的寿命,且耗资巨大。肌萎缩侧索硬化症的发病机制尚不完全明确,近年来大量学者对肌萎缩侧索硬化症致病蛋白进行了研究,但多数是重复性验证研究,已发现的致病蛋白只能解释肌萎缩侧索硬化症的部分发病机制。找到敏感的疾病相关蛋白,不仅可以达到早期诊断ALS、跟踪疾病进展、评估治疗后的反应的目的以及更好地理解ALS的分子发病机制,同时也为此后进一步阐明SOD1-G93A突变相关ALS的生物通路和分子机制建立基础,很多学者均致力于寻找关于ALS的疾病相关蛋白的研究。我们这项研究主要也是寻找与肌萎缩侧索硬化症发病相关的新蛋白。我们前期应用iTRAQ技术对SOD1-G93A转基因小鼠的脑和脊髓进行了蛋白组学分析,筛选出在脑和脊髓中表达均有差异且意义较大的蛋白,然后应用免疫荧光及Western技术对筛选出的蛋白进行探查,分析ALDH1A2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中表达和分布的规律,并分析ALDH1A2阳性细胞在神经细胞的共定位。方法:将正常的C57BL/6J小鼠与SOD1*G93A转基因小鼠进行交配繁殖,构建动物模型,用PCR技术检测和筛选SOD1-G93A阳性子代小鼠,采用Western blot对实验组和对照组小鼠ALDH1A2阳性细胞的表达量进行分析;利用荧光免疫组织化学单标技术对实验组和对照组小鼠ALDH1A2阳性细胞的分布特征进行观察和分析,应用Image-Pro Plus 6.0软件对ALDH1A2阳性细胞数、计算阳性细胞率进行统计;采用免疫荧光双标记技术,分别标记神经元细胞(Fox3/NeuN)、少突胶质细胞(Oligodendrocyte)、星形胶质细胞(GFAP)、小胶质细胞(IBA-1),用荧光免疫组织化学染色法对每一解剖区同时进行双重染色,然后利用图像处理技术将染色的阳性细胞叠加成像,在显微镜下观察和分析阳性细胞和神经细胞的共定位关系。结果:本研究是首个针对ALDH1A2与ALS相关性的研究,得到以下结果:(1)ALDH1A2的前期iTRAQ分析结果本实验室前期iTRAQ分析结果,与正常野生型小鼠相比,ALDH1A2是一种在SOD1-G93A转基因小鼠脑和脊髓中均有表达的差异蛋白,表达水平呈现如下规律:在SOD1-G93A进展组小鼠及正常对照组小鼠脊髓组织中的丰度比为0.63,实验组<对照组;在实验组中,未发病组<进展组<发病组。(2)Western blot的验证结果与前期iTRAQ蛋白组学分析的结果完全一致,即对照组小鼠脊髓中ALDH1A2的表达水平高于实验组小鼠脊髓。(3)免疫荧光双标实验的验证结果观察到ALDH1A2阳性细胞与FOX3/NeuN、IBA1、Oligodendrocyte、GFAP阳性细胞在实验组和对照组小鼠脊髓灰质内均存在共定位,说明了ALDH1A2能在上述四种细胞中表达。(4)免疫荧光单标实验的验证结果ALDH1A2阳性细胞广泛分布于实验组和对照组小鼠的脊髓灰质和白质内。疾病作为独立影响因素时,ALDH1A2阳性细胞百分率对照组>实验组,两组比较具有统计学意义(P=0.02);节段作为独立影响因素时,ALDH1A2阳性细胞百分率颈段>胸段>腰段,三组比较有显著统计学意义(P=0.00),两两比较除颈段和胸段相比无明显差异外,颈段和腰段相比、胸段和腰段相比均有统计学差异;区域作为独立影响因素时,白质各区域>灰质各区域,六组比较有显著统计学意义(P=0.00),灰白质之间两两相比无明显统计学差异;年龄作为独立影响因素时,ALDH1A2阳性细胞百分率发病组>进展组>未发病组,三组比较有显著统计学意义(P=0.00),且两两比较均有统计学差异;年龄和疾病因素对小鼠脊髓ALDH1A2阳性细胞百分率的影响存在交互作用,一个影响因素的变化均可引起另一个因素的变化。结论:ALDH1A2蛋白在SOD1-G93A转基因小鼠及正常对照小鼠脊髓不同解剖区域、不同节段、不同年龄阶段的表达和分布规律:ALDH1A2阳性细胞广泛分布于对照组和实验组小鼠的脊髓灰质和白质内,当年龄、解剖区域、疾病、节段作为独立因素存在时,均可影响小鼠脊髓ALDH1A2的阳性细胞百分率,呈以下规律:对照组>实验组、白质>灰质;年龄和疾病因素对小鼠脊髓ALDH1A2阳性细胞百分率的影响存在交互作用;ALDH1A2阳性细胞与小鼠脊髓的神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞存在共定位,且主要表达于胞质。在脊髓的一些解剖区域可能发生了阳性细胞再分布现象,但未检测到其在不同神经细胞中的再分布。ALDH1A2可能是ALS的疾病相关蛋白。