铅是严重危害人类健康的主要环境化学危险因素之一。发育期儿童由于其行为和生理的差异,以及高吸收率、低排泄率等特点,对铅毒性更为敏感。越来越多的证据表明铅损害儿童的健康。铅的毒性可影响机体几乎所有系统,包括神经系统、血液系统和内分泌系统等,其中,神经系统对铅毒性最为敏感,且铅对神经系统的损害是永久性的、不可逆的,从而导致认知障碍、影响智力发育及学习记忆功能。从2009年至2011年初,全国范围内近4000学龄儿童发生了铅中毒,因此目前我国儿童铅中毒的形式十分严峻。调查显示,我国有10%-15%的城市儿童和20%的农村儿童血铅超标(大于100μg/L)。由此可见,儿童铅中毒不仅是一个医学问题,更是一个社会问题。进一步探讨铅神经毒性的机制及相应的防护措施迫在眉睫。铅的毒性机理仍然不清。冷诱导的RNA结合蛋白(cold inducible RNA binding protein,Cirbp)是哺乳动物细胞内最早发现的温和低温应答蛋白。Nishiyama等1997年首次在小鼠的睾丸细胞中分离鉴定出Cirbp,是富含甘氨酸的RNA结合蛋白家族(glycine-rich RNA-binding protein family,GRP),包含一个C端富甘氨酸区和一个N端共有序列RNA结合域(consensus sequence RNA binding domain,CS-RBD)。Cirbp参与人和动物的神经系统发育、胚胎发育、昼夜节律等多种功能,在低温、紫外线、缺氧、渗透压改变等条件下表达显著增多。近年来有研究证实,在铅诱导的细胞损伤中伴随着抗氧化物质硫氧还蛋白(thioredoxin,trx)水平的降低,后者可以直接清除ros。cirbp可以同trx的3’-utr特异性地结合来增加其翻译,抑制tnf-α在低温时诱导的细胞凋亡,并且这两个过程都伴随磷酸化erk水平的明显增高,这说明cirbp可以通过激活erk信号通路发挥抗凋亡作用。因此,本实验旨在通过建立铅的细胞毒性模型,观察cirbp蛋白是否参与其中,并且对其机理进行深入探讨。目的:通过建立铅的细胞毒性模型,观察cirbp在铅暴露后的表达变化,探讨cirbp蛋白在铅诱导的细胞毒性中的作用及其分子调控机制,从而为铅毒性的预防和治疗提供一个新的思路和方向。方法:1.不同浓度醋酸铅(0、2.5μmol/l、5μmol/l和10μmol/l)作用于pc12细胞,通过mtt检测铅对细胞增殖的影响;dcfh-da探针法、rh123法和mda法检测线粒体ros生成、膜电位和脂质过氧化程度的改变;tunel和westernblot方法检测细胞凋亡。2.针对cirbp核苷酸序列,设计并合成cirbp反义寡核苷酸,将载体质粒plvx-mcmv-zsgreen-puro的ecorΙ和bamhΙ位点双酶切后连接构建plvx-cirbp-mcmv-zsgreen-puro慢病毒表达载体,pcr方法筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。将含cirbp目的基因的重组质粒plvx-cirbp-mcmv-zsgreen-puro导入293t细胞;同时做zsgreen对照病毒,以293t细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度。重组慢病毒感染pc12细胞,提取全基因组做pcr鉴定。3.铅(5μmol/l)作用于高表达cirbp细胞和对照载体细胞后,mtt法检测反义cirbp重组慢病毒对pc12细胞增殖能力的影响,westernblot法检测cirbp、抗氧化蛋白trx和凋亡相关的蛋白bax和bcl-2表达的变化;dcfh-da探针法和mda法检测铅对线粒体ros生成和脂质过氧化程度的影响。4.erk抑制剂pd98059预处理pc12细胞30min后,铅(5μmol/l)作用24h,westernblot检测p-erk、erk、cirbp、trx、bax和bcl-2蛋白的表达;同时dcfh-da探针法和mda法检测线粒体ros生成、膜电位和脂质过氧化程度的影响。结果:1.铅诱导细胞、线粒体损伤以及氧化应激水平的升高:铅作用于pc12细胞后,mtt结果显示铅对pc12的细胞增殖有抑制作用,且呈时间剂量依赖性;dcfh-da和mda检测结果显示细胞内ros和mda的生成增加;rh123结果显示线粒体膜功能受到破坏;tunel和bax/bcl-2结果显示细胞的凋亡增加。2.成功构建慢病毒感染高表达cirbp细胞系:westernblot结果显示铅暴露降低cirbp蛋白表达;用慢病毒表达载体感染pc12细胞,westernblot和rt-pcr鉴定结果均表明获得了稳定表达cirbp蛋白的细胞。3.cirbp对铅细胞毒性具有保护作用:mtt结果显示,同对照组细胞相比,cirbp高表达后对细胞的增殖有一定的促进作用。dcfh-da、mda和bax/bcl-2结果显示铅暴露后cirbp高表达细胞ros的生成、脂质过氧化程度和bax/bcl-2比值与对照组相比有一定程度的降低,提示高表达cirbp对铅的细胞毒性有保护作用。4.cirbp可以正反馈调节trx的蛋白表达:westernblot结果显示,铅作用于pc12细胞后,trx呈剂量依赖性降低;高表达cirbp后可以逆转铅诱导的trx表达降低。同样的方法建立了慢病毒感染的高表达trx细胞系,westernblot和rt-pcr鉴定结果均表明获得了稳定表达trx的细胞系。结果显示,高表达trx后,对铅诱导的细胞毒性具有保护作用,且对cirbp的表达没有显著影响,提示cirbp可以正反馈调节trx的蛋白表达。5.高表达trx对铅毒性的保护作用同erk信号通路有关:铅暴露可以诱导erk1/2磷酸化水平增加;高表达cirbp和trx后,铅诱导的erk1/2磷酸化水平的增加受到一定程度的抑制;加pd98059阻断erk激活后,铅诱导的ros生成、脂质过氧化程度和bax/bcl-2比值与对照组相比有一定程度的降低,提示在铅暴露时,高表达trx对铅毒性的保护作用同erk信号通路有关。结论:通过铅中毒的细胞模型与高表达Cirbp细胞系和高表达TRX细胞系的建立,发现Cirbp可能通过调节下游的TRX蛋白的表达抑制铅的细胞毒性作用,且这种抑制作用与ERK通路相关,研究结果将为铅毒性的预防和治疗提供理论依据。