目的伴复杂核型急性髓系白血病（acute myeloid leukemia with complex karyotype,CK-AML）大约占成人AML的10%～15%，并且随着年龄的增长，发生率增加。复杂核型是AML独立的预后不良因素，临床化疗缓解率低，预后差，缺乏有效的化疗方案。研究复杂核型形成机制有望找到有效的治疗靶点，改善患者预后。本研究通过核型分析筛选初发急性髓系白血病伴复杂核型患者，从P53抑制因子鼠双微体基因4（mouse double minute4，MDM4）及其短剪接体(short isoformof MDM4, MDM4-S)与复杂核型形成关系入手，检测CK-AML与正常核型AML患者MDM4及MDM4-S的表达水平，并构建MDM4S慢病毒载体，感染表达野生型P53的HepG2细胞株，观察细胞周期、细胞增殖、P53通路相关蛋白和纺锤体检查点相关蛋白表达的变化，从而在细胞和分子水平探讨复杂核型形成的可能机制。方法1.采用G/R显带核型分析筛选具有复杂核型的初发AML患者总结患者特征和预后，对140例初发AML患者进行G/R显带核型分析，具有3种或3种以上的染色体异常者，即确定为伴有复杂核型的AML患者。2.采用PCR、RT-PCR及实时定量RT-PCR检测相关基因突变及MDM4FL、MDM4S的表达提取140例初发AML患者骨髓样本的DNA及总RNA，通过PCR、RT-PCR及实时定量RT-PCR方法检测TP53、FLT3-ITD、AML1基因突变、MDM2、MDM4及其剪接体MDM4-S的表达水平等，分析各种相关基因的突变及MDM4-S/MDM4-FL比值的变化。3.构建MDM2、MDM4S慢病毒表达载体设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物，上游引物包含起始密码子，下游引物包含终止密码子，以K562细胞cDNA为模板，高保真酶扩增目的基因，通过与载体双酶切，连结，转化感受态，挑克隆测序，将含有正确克隆的菌液摇菌提质粒，-20℃保存备用。将构建成功的各表达质粒pCDH1-MDM2、pCDH1-MDM4S分别与包装辅助质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-G磷酸钙共沉淀法共转染293T细胞，包装病毒颗粒，进行滴度测定。包装好的病毒感染HepG2细胞株，并筛选阳性细胞株，扩大培养。4.细胞周期、细胞增殖活性以及P53、P21、BubR1、Securin mRNA和蛋白水平表达检测稳定感染MDM2、MDM4S的HepG2细胞，在中期阻滞剂Nocodazole处理18小时后，收集细胞，固定，PI染色，流式细胞仪观察细胞周期；采用MTT法检测细胞增殖情况；RT-PCR及Western-blot检测P53、P21、BubR1和Securin基因mRNA和蛋白水平表达变化。结果1.在140例初发AML患者中筛选出15例复杂核型患者1.115例复杂核型患者的一般特征及预后15例复杂核型患者中，男女比例为8:7；年龄≥60岁7例，占46.7%；白细胞数＞100×109/L者2例，占13.3%；FAB分型：M01例，M24例，M45例，M55例；核型中，-5：2例，-7：4例，-17：2例，+21：9例；治疗效果，3例经过1次化疗达到CR，1例经过2次化疗达到CR，部分缓解2例，放弃治疗2例。转归：目前死亡13例，存活时间中位数为292天（66-738天）。1.215例CK-AML患者核型分别为：(1)49,XY,+13,+19,+21(2)52,XXX,+10,+13,+16,+21,+22(3)54,XXX,+8,+11,+15,+16,-17,+19,+20,+21,+22(4)47,XXY,+1,-2,-5,+12,-17,+19,+21,-22(5)56,XXXY,+1,-2,+10,+11,+12,+15,+20,+21,+21,+22(6)49,Y,+1,+5,-7,+8,+13,+21(7)50,XX,+16,+19,+20,+21(8)51,XX,-7,+13,+15,+21,+21,+21,+22(9)92,XXXX(10)49,XY,+6,add(7)(p22),+8,add(11)(q25),+15(11)49,Y,+1,+5,-7,+8,-11,+13,+22,+t(11;17)(q23;q21)(12)51,XY,-7,+13,+15,+16,+19,+22,+22(13)48,XXY,+1,-2,-5,+12,+18(14)50,XX,+1,-7,+8,+13,+15,+19(15)51,XXX,+10,+13,+15,+162.初发急性髓系白血病相关基因突变及MDM4-S/MDM4-FL表达分析2.1基因突变检测结果15例CK-AML患者TP53基因在DNA及RNA水平均未检测出突变，但通过FISH检测有两例TP53丢失一个拷贝；AML1基因各个外显子未检出突变；FLT3-ITD突变率在CK-AML为20%，正常核型AML为23.2%，二者差异无统计学意义（P＞0.05）。2.2相关基因表达量检测结果半定量RT-PCR检测复杂核型组与正常核型组的两种剪接体MDM4-S、MDM4-FL相对表达量，结果发现复杂核型组MDM4S/MDM4FL比值和MDM4-S/MDM4-total比值均高于正常核型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。实时定量RT-PCR检测MDM2、MDM4FL和MDM4S表达量，经统计学分析，复杂核型组与正常核型组相比，MDM2表达水平无差异（P＞0.05），复杂核型组MDM4-FL和MDM4-S相对表达量高于正常核型组，差异具有统计学意义。（P＜0.05）3．MDM2、MDM4-S基因慢病毒表达载体的构建与感染通过测序鉴定，MDM2、MDM4-S序列与GeneBank中序列一致，读码框未发生移位。包装病毒并进行滴度测定。包装好的病毒感染HepG2细胞株，并筛选阳性细胞株，扩大培养。本实验中阳性率达到了60%～80%，得到纯度较高的稳定转染了目的基因的细胞。4.细胞周期及细胞增殖实验4.1细胞周期检测Nocodazole处理18h后，空白质粒组细胞停留在4N，即M期百分比为51.94%，其余两组4N的百分比分别为：MDM2:33.35%; MDM4S:37.32%。与空白对照组相比，稳定转染MDM2和MDM4S的两组细胞4N细胞比值减少，即M期所占比例减少，具有统计学意义（P＜0.05）。4.2Nocodazole处理不同时间点G0/G1期细胞所占的比例在Nocodazole处理0h，G0/G1期细胞所占的比例大约在40%～60%，到8h，三组细胞G0/G1期细胞所占的比例明显下降，随着作用时间的延长，三组细胞G0/G1期细胞所占的比例逐渐上升，在Nocodazole处理18h时稳定转染MDM2和MDM4S的两组细胞与空白对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明中期阻滞在MDM4S组降低。4.3细胞增殖实验MTT检测空白质粒组、MDM2和MDM4S细胞活性，与空白对照组比较，稳定表达MDM2与MDM4S细胞增殖活性升高，具有统计学意义（P＜0.05）。5. Real-time RT-PCR5.1稳定表达MDM2、MDM4S组TP53mRNA相对表达量与空白质粒组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。5.2Nocodazole处理组与对照组相比，稳定表达MDM2、MDM4S组BubR1mRNA表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；稳定表达MDM4S组Securin mRNA表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Nocodazole处理空白质粒组，Securin mRNA表达升高，与DMSO处理组相比具有统计学意义（P＜0.05）。6. western-blot检测6.1P53、P21表达水平稳定表达MDM2细胞P53、P21表达水平下降，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）。稳定表达MDM4S细胞P21蛋白表达水平降低，与对照组相比具有统计学意义；P53蛋白表达水平与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。6.2BubR1、Securin表达水平Nocodazole处理后18h后，稳定表达MDM2和MDM4S细胞中BubR1蛋白和Securin蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。空白质粒组在Nocodazole处理后，Securin蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.复杂核型组MDM4-S相对表达量高于正常核型组。2.稳定转染MDM2、MDM4-S细胞株纺锤体检查点功能减弱。3.提高细胞内MDM4S/MDM4FL比值，可抑制P53通路活性。4.表达野生型P53的急性髓系白血病患者复杂核型的形成与MDM4-S高表达抑制P53通路活性，进而导致纺锤体检查点功能减弱有关。