二化螟温州种群Cry1Ab抗性基因频率的F2检测及氨肽酶N基因CsAPN3的克隆

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二化螟Chilosuppressalis(Walker)是我国水稻上一种重要害虫,目前主要依靠化学杀虫剂进行控制。转Bt基因抗虫水稻(Bt水稻)为防治二化螟提供了一种新的有效方法,Bt水稻在几年后将在中国实现商业化种植。在Bt水稻未商业化种植之前检测二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,可以为制定预防性抗性治理策略、实施二化螟Bt早期抗性的监测和预警提供重要依据。本研究采用F2筛选法(F2 screen)检测了浙江温州地区二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,并对进行了室内抗性品系的筛选;同时对二化螟的一个氨肽酶N基因(CsAPN3)进行了克隆、序列分析和mRNA表达检测。
  1.F2筛选法检测二化螟温州种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率
  2009年从浙江温州田间水稻上采集一代二化螟卵块,每一卵块单独饲养以建立单雌系。用Cry1Ab区分剂量对201个单雌系F2代进行了检测,发现田间种群存在对Cry1Ab的主要抗性等位基因,抗性等位基因频率估计为0.0025(95%置信区间:0.0019-0.0031)。
  2.二化螟对Cry1Ab抗性的室内筛选
  将F2检测中7个候选单雌系在区分剂量下的存活幼虫建立一个混合种群,并用Cry1Ab对其进行室内抗性筛选。连续筛选6代后,该种群对Cry1Ab的敏感性明显下降,在区分剂量下的存活率由筛选前的5%提高到35%。与苍南敏感品系相比,该筛选种群对Cry1Ab已具有10倍的抗性。
  3.二化螟氨肽酶N基因CsAPN3的克隆、序列分析及mRNA表达
  利用RT-PCR和RACE技术,获得二化螟一个氨肽酶N基因的全长cDNA。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫APN的相似性,命名为CsAPN3。CsAPN3全长cDNA含有3363bp,其开放式阅读框编码1013个氨基酸。该基因具有氨肽酶所特有的保守区域GAMEN和锌结合结构域HEXXHX18E。在CsAPN3的N-末端含有20个疏水信号序列,但C-末端没有一个具有亲脂性和跨膜特性的糖基化磷脂酰肌醇锚定点。通过实时定量PCR检测发现,二化螟Csapn3mRNA主要在幼虫阶段表达,幼虫中肠中Csapn3mRNA表达量明显高于其他组织。
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