一、背景与目的冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是临床常见病、多发病，严重的危害人类健康。冠心病的最严重类型---急性心肌梗死(AMI)，因冠状动脉急性闭塞和心肌组织急性缺血，可在15～20分钟内导致心肌细胞不可逆性损伤。心肌梗死后心室发生重构，随之而来的是心肌细胞被替换为纤维组织，导致心肌细胞收缩功能减退或消失，继之出现左心室扩张等病理改变。间充质干细胞是已经是比较获得认可的可用于心脏移植的细胞类型,在心肌梗死后，间充质干细胞移植可以减少坏死，分泌许多促进血管生成的细胞因子和改善心脏功能,还有研究认为间充质干细胞可作为支持心肌干细胞生长重要的支持细胞。如间充质干细胞可以招募许多的内源性干细胞，这些干细胞为损伤部位带了了修复，而非仅仅间充质干细胞，这其中就包括了非常有潜力的心肌干细胞。在对病窦综合征的研究中，HCN基因家族修饰的间充质干细胞用于重建起搏点。如何更好的促进间充质干细胞移植后的分化和移植后的效果也是研究人员不断探索的方向，其中分子手段是比较有效的方式，但由于慢病毒等手段的临床应用受到限制，而在心血管内科治疗中各种物理手段在临床应用较多，那么可否使用物理手段干预间充质干细胞分化过程？或者改变间充质与心肌共培养层分化状态？在正常生理状态过程中，内源性的电流、电场扮演了影响分化的重要角色，内源性的电场对于胚胎的分化作用十分重要。本课题的目的是探求外源性电干预可否作为促进间充质向心肌分化或者改变间充质与心肌共培养层分化状态的一种手段的可能性与可行性，寻找合适的电干预参数，设计制作方便实用的电干预系统，了解间充质干细胞向心脏分化潜能，寻找其作用的靶点和初步确定了解合适的干预时间。二、研究方法1.反复结合EPCS使用效果反馈制作了EPCS培养装置。2.膜片钳检测电流干预对共培养条件下间充质干细胞膜电位的影响，3.将间充质干细胞分为普通培养组和EPCS处理组，检测EPCS对其增殖(cck-8andPCNA)，表面标记物，形成缝隙连接潜力影响。检测EPCS对其搏动维持，搏动频率，及肌钙蛋白，肌球蛋白表达在转录水平的影响。4.将5-aza处理后的3w后的小鼠间充质干细胞分为普通培养组和EPCS组，检测EPCS对其诱导效果影响。5.间充质干细胞分化情况检测：间充质干细胞与心肌共培养4-5天后分别检测CX43，Nav1.5，CaMKⅡ表达情况；将间充质干细胞和心肌细胞按4:1比例种植于培养皿中，取48h，72h和96h进行western-blotting实验，检测CaMKⅡ含量的动态变化。6.共培养5天后，检测共培养层GATA4,MEF2c,TBX5相关转录因子表达的情况；检测蛋白质核转运受体在共培养层表达。7.将细胞分为两组，普通共培养培养组和钙离子通道阻滞共培养组。共培养5天后，检测细胞上VSCC(电压敏感钙通道)的表达和钙瞬变情况。检测MEF2C，GATA4和TBX5表达情况。检测细胞钙调神经磷酸酶活力；western-blotting检测细胞TroponinT， NAV1.5， CACNA1G/H和CX43蛋白含量变化。8.间充质和心肌细胞在初期接种时的比例为３：１。每组给予1h/d，3h/d和6h/d的EPCS干预，EPCS从接种后24h开始，持续4天，同期接种的未进行EPCS干预的共培养细胞作为对照组。用蛋白印迹法检测troponinT和CX43在每个不同时间处理组表达含量。9.用免疫荧光检测EPCS连续处理5d组，及对照组在S100A4，MEF2C,troponinT,CX43和GATA4表达情况。三、研究结果1.结合试验反馈反复摸索分析中制备了一套稳定可靠的电刺激给予和接受装置(EPCS培养系统)，我们可实时对其干预信号监测，这套系统便于使用和准确给予EPCS刺激。2.膜片钳检测显示在共培养条件下的间充质干细胞在接受到膜片钳仪器提供直流电流刺激后产生膜电位微小改变。3.在心肌细胞长期体外培养中EPCS可以维持少数区域较良好的搏动状态和形态。4.安全性检测方面：EPCS对心肌细胞搏动频率未见明显影响；.EPCS不影响间充质干细胞增殖(cck-8实验，PCNA蛋白含量检测)，形成缝隙连接的潜能；EPCS对间充质干细胞表面标记物中的CD44分子具有轻度下调作用，不随每日干预时间延长增加下调幅度；EPCS处理9天，在体外培养共计12天的心肌细胞其肌钙蛋白，肌球蛋白基因转录水平未见影响。EPCS对5-aza诱导的间充质干细胞过程未见影响。5.狗间充质干细胞心肌分化潜能鉴定：在于心肌细胞共培养后，间充质干细胞可以出现缝隙连接蛋白，钠离子通道Nav1.5，CaMKⅡ，和转录因子GATA4，MEF2C和TBX5表达。GATA4在心肌细胞核的浓度远高于间充质干细胞，是其在间充质细胞核的4.49倍，P<0.01。间充质与心肌细胞培养层(4：1)中CaMKⅡ含量随共培养时间延长逐渐升高，CaMKⅡ表现出强上升趋势，尤其是共培养后72-96小时。在核转运受体中， Karyopherinα3的分布间充质干细胞和心肌细胞的分布有比较明显的差异，Karyopherinα4和Karyopherinα5在间充质干细胞和部分心肌细胞上存在差异，Karyopherin β1，Karyopherin α1/6，和Karyopherin α2在间充质干细胞和心肌细胞的分布无明显差异，其中Karyopherin α3表达更强的心肌细胞的阳性比例与核富集GATA4心肌细胞的比例相似(90%)。钙通道阻滞诱发原代培养心肌细胞内成纤维细胞强烈增生和S100A4表达升高。间充质干细胞表面钙离子离子通道的形成较强依赖于正常钙电流活动。阻断钙离子流培养对间充质干细胞钙瞬变产生幅度减小和时间缩短影响。钙离子通道阻滞导致间充质心肌细胞共培养层部分心肌转录因子升高，但未见引发下游结构蛋白含量增高。6.CX43和TroponinT随每天EPCS干预时间的延长显示出逐渐上升趋势。CX43在3h/d组和6h/d组表现出1.5倍和1.7倍的升高(与对照组比较,p<0.01)；肌钙蛋白T在3h/d和6h/d组表现出3.6倍(P<0.01)和4.4倍(P<0.05)的升高。7.在5天连续的EPCS处理后，发现S100A4升高显著，其在心肌细胞是对照组的2.33倍(P<0.01)在间充质干细胞是对照组的1.99倍(P<0.01)。在心肌细胞MEF2C和GATA4的表达量升高了1.63倍(P<0.01)和1.57倍(P<0.01)，在心肌细胞EPCS可促进MEF2C在细胞核集中表达，同时我们也发现了更多数量的双核心肌细胞，MSC则对于EPCS触发出现的MEF2C升高没有反应， MEF2C在心肌细胞胞浆和细胞核的升高可以将共培养体系中的心肌细胞和间充质干细胞较清晰区分开来。也有一些指标在EPCS处理后在心肌细胞和间充质干细胞均出现升高，这包括强烈升高的troponin T和升高幅度相对弱些的CX43，其中肌钙蛋白T在心肌细胞为对照组的2倍(P<0.01)，CX43的表达在心肌细胞为对照组的1.4倍(P<0.05)；在间充质干细胞肌钙蛋白T为对照组1.88倍(P<0.01)，CX43为对照组的1.94倍(P<0.01),在共培养层中，EPCS组心肌细胞S100A4和troponin t出现了明显的核聚集现象，极少MSC上有此现象。四、结论1.合适的EPCS干预是一种非常有效地多靶位干预间充质干细胞和心肌细胞共培养层分化程度的物理方式。2.间充质干细胞细胞核中GATA4得含量远低于其在心肌细胞核含量。在蛋白核转运受体中，Karyopherin3的分布间充质干细胞和心肌细胞的分布有比较明显的差异，Karyopherin4和Karyopherin5在间充质干细胞和部分心肌细胞上存在差异。3.间充质干细胞钙离子通道的形成依赖于共培养后共培养层正常钙电流活动。4.间充质干细胞在接受EPCS方面的敏感性和广泛性上不及心肌细胞。EPCS处理后，S100A4，TroponinT虽然有整体水平升高，但心肌出现的出现的核内较胞质更加富集现象在间充质干细胞鲜见，提示间充质干细胞部分分化障碍可能和重要分化相关蛋白质主动转运入核相关。在心肌细胞和间充质培养层中，心肌分化重要转录因子MEF2C在间充质干细胞的表达不受EPCS干预升高，而在心肌细胞升高，提示间充质干细胞本身对EPCS感受性有限。5.EPCS引起间充质干细胞S100A4升高，而既往文献认为S100A4是顶叶内胚层分泌促进心肌分化的因子之一，说明EPCS可能增强间充质干细胞在间充质干细胞与心肌细胞共培养层的支持作用。