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骨肉瘤在原发恶性骨肿瘤中最常见，主要见于15～25岁少年，男多于女约一倍。该瘤恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为5～20％。发生在股骨下端及胫骨上端的约占所有骨肉瘤的四分之三，其它处如肱骨、股骨上端、腓骨、脊椎、髂骨等亦可发生。多数为溶骨性，也有少数为成骨性。肿瘤多处于骨端，偶发生于骨干或骨骺。尽管目前肿瘤治疗手段的日益改善，但对于大多数晚期骨肉瘤患者真正有效的治疗措施十分有限，化疗仅对部分患者有效。因此，临床迫切需要高效低毒的新治疗手段。目前，骨肉瘤的发病机制仍不清楚。但同其它肿瘤一样，癌基因，抑癌基因，凋亡相关基因，生长因子及受体的异常表达及细胞内信号传导的紊乱被认为与骨肉瘤的发生和转移密切相关。表皮生长因子受体(EGFR)，是目前最受注目的肿瘤治疗药物的靶位。大量研究表明，EGFR酪氨酸激酶区域是调节肿瘤细胞增殖、侵袭、血管生成、转移和凋亡信号通路的重要部分。表皮生长因子EGF与EGFR的结合导致EGFR的二聚体化和胞内区磷酸化，进而引发一系列的级联放大反应，从而调控和传递骨肉瘤的生物学行为的信号。研究发现EGFR在人骨肉瘤组织中过表达，且其表达水平和恶性预后相关，EGFR抑制剂有望被开发成为骨肉瘤的崭新治疗途径。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(PTGS)，dsRNA经RNA沉默复合体(RISC)降解成21-23nt的小片段(siRNA)，并以其为模板，特定位点、特定间隔降解与之序列互补的mRNA，目前已成功用于基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系的研究。本研究拟通过采用RNAi技术，探讨利用体外化学合成siRNA和构建质粒载体的方法是否能有效沉默骨肉瘤细胞EGFR基因表达，阻断EGFR所介导的恶性生物学行为，从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。目的探讨采用RNAi技术是否能有效抑制骨肉瘤MG63细胞株EGFR表达，以及EGFR基因下调后骨肉瘤MG63细胞生物学特性的改变，以期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据。材料与方法首先通过免疫组化、RT-PCR和western blot测定MG63细胞株EGFR的表达情况。体外合成短发夹状shRNA—EGFR单链，并通过退火、回收、质粒酶切、连接、转化、挑克隆、提质粒、测序等步骤，构建和鉴定重组质粒载体psilencer-2.1-shRNA-EGFR，转染MG63细胞株。建立实时荧光定量RT-PCR定量检测EGFRmRNA的表达量的方法。用实时荧光定量RT-PCR检测shRNA对靶mRNA沉默效率；用western—blot法检测蛋白表达变化情况；用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析检测细胞体外增殖率情况；通过DAPI染色观察干扰后的细胞调亡情况；透射电镜和原位末端标记TUNEL法观察细胞凋亡形态学改变；Annexin V/P I双标记法检测细胞的早期和晚期凋亡率改变。结果我们建立了EGFR基因干扰载体并建立荧光定量PCR检测技术平台。通过免疫组化、RT-PCR和western blot证实MG63细胞株存在EGFR高表达。Psilencer2.1-shRNA-EGFR-Lipofectamine 2000复合物转染细胞可引发EGFR序列特异性基因沉默效应，与RT-PCR、Western Blot分析得到了一致的结果。干扰组骨肉瘤细胞与对照组比较，shRNA-EGFR组EGFR基因水平在12h、24h、48h、60h和72h分别下调16.2％、27.3％、47.7％、52.3％及54.5％(P＜0.01)；shRNA-EGFR组EGFR蛋白表达水平也明显下调。MTT法检测EGFR对MG63细胞增殖抑制率在12h、24h、48h、60h和72h分别为12.6％、30.0％(P＜0.01)、39.1％(P＜0.01)、47.1％(P＜0.01)和62.1％(P＜0.01)。shRNA-EGFR诱发的调亡细胞细胞核DAPI染色明显增强，胞核缩小，核膜皱缩，染色质凝聚、边缘化，晚期染色质破碎。TUNEL检测RNA干扰48h后的细胞，可见明显的棕色细胞，表明凋亡细胞的存在。经EGFR干扰48h的人MG63细胞，电镜观察发现干扰后细胞细胞核体积缩小，胞浆内出现大小不等的空泡，细胞浆浓缩，整个细胞固缩，并可见脱落到细胞外的凋亡小体。Annexin V／P I检测EGFR干扰MG63细胞，干扰前凋亡检测值为1.9％，坏死为0.7％；干扰后24h凋亡检测值为12.6％，坏死为5.39％；48h凋亡凋亡检测值为31.6％，坏死为5.1％，72h凋亡凋亡检测值为36.2％，坏死为24.3％。结论1．MG63细胞株存在EGFR高表达。2．shRNA-EGFR可序列特异性下调MG63细胞EGFR基因水平，显著降低EGFR蛋白表达。3．shRNA-EGFR重组质粒通过抑制EGFR表达可抑制细胞增生和诱发调亡，从而为MG63基因治疗提供了新策略。