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目前，肺癌已居人类肿瘤致死的第一名，全世界泛围内，科学家们一直积极采用各种方法来治疗肺癌，但治疗效果不能令人满意，肺癌总的治愈率仍不足14％。随着分子生物学的不断发展，人类对肺癌的发生发展转移的分子机制有了更深的认识。基因治疗已成为一种极具前景的新方法。反义脱氧寡核苷酸(antisense digodeoxynucleotides；ASODN)是一段与mRNA或DNA特异性结合，并阻断其表达的人工合成分子。ASODN可封闭或抑制肿瘤细胞关键编码基因，从而特异性抑制肿瘤细胞的增殖。反义药物是以反义核酸技术为基础开发的，以治疗为目的，安全有效的新型药物。近年来，随着对反义寡核苷酸及其结构衍生物如硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸反义机理的阐明，大量以病毒，癌基因，细胞活性因子及其它疾病相关蛋白为靶点的反义药物相继进入临床试验阶段，使反义药物的研究再次进入蓬勃发展时期。基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组重要的含锌离子的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解酶。目前已鉴定出约20多种MMPs，基质金属蛋白酶-9是其中重要的一组酶，可在许多肿瘤组织中表达。还在肿瘤的凋亡，侵袭和转移中起着关键性作用。本研究采用人肺腺癌A549细胞株，运用脂质体介导的MMP-9ASODN转染该细胞，通过MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长的影响；RT-PCR观察MMP-9mRNA蛋白的表达；Western blot检测MMP-9蛋白的改变；流式细胞术检测MMP-9ASODN对A549细胞增殖和凋亡比率；MTT比色法和划痕迁移试验观察MMP-9ASODN对A549细胞体外粘附以及迁移的能力；最后观察MMP-9ASODN的体内抑瘤效果，进而为肺癌的基因治疗提供一种新方法。肺癌靶向治疗药物的研究已进入开发阶段，目前有众多的反义药物已进入临床实验阶段。本研究旨在证明反义寡核苷酸MMP-9转染A549细胞后，可抑制肿瘤细胞生长，并诱导其凋亡，从而为肺癌的反义基因治疗提供了可靠的实验依据。方法1．脂质体介导的寡核苷酸转染A549细胞人肺腺癌A549细胞在1640完全培养基中常规培养，进入对数生长期后接种于96孔板，分四组进行实验，即MMP-9ASODN，MMP-9SODN，脂质体组和空白对照组，转染后24h以荧光倒置显微镜观察，随机选取5个高倍镜视野，计数全部细胞数和发绿色荧光细胞数，计算转染率。2．MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长的影响ASODN转染组加设不同浓度组即200nmol／L，400nmol／L，600nmol／L和800nmol／L的ASODN转染。每组设3个复孔，分别于转染0h，4h，8h，12h，24h，48h，60h后行MTT实验。酶标仪上测定波长为570nm，计算A549细胞的存活率。3．流式细胞术检测细胞增殖和凋亡比率收集经处理后的各组细胞于离心管内，离心，洗涤，固定，染色，置流式细胞仪上，在激发波长为488nm处进行检测，计算细胞凋亡比率。4．RT-PCR法检测MMP-9mRNA的表达转染后收集各组细胞，进行RNA提取，定量后以其为模板逆转录合成cDNA链，然后用引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。5．Western blot检测MMP-9蛋白的改变收集转染24h细胞提取细胞中总蛋白，测定出样品的蛋白质含量，然后将蛋白质在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色，转膜观察结果。6．MMP-9ASODN转染对A549细胞体外粘附及体外迁移的影响检测包被及水化基底膜，接种及培养细胞，然后MTT比色法检测，计算细胞粘附率。同样包被及水化基底膜，制备培养单层细胞，用人工划痕法，在相差显微镜下随机选择5个100×视野内计算迁移到划痕空隙中的细胞总数。7．裸鼠模型抑瘤率观察构建移植瘤裸鼠模型后，MMP-9ASODN直接移植瘤内注射，观察其抗移植瘤生长效应，包括一般状况，局部实体瘤生长抑制率的测定以及病理组织学检测。结果1．MM-9ASODN组，MMP-9SODN组和Lip组转染效率分别为(65.85±9.61)％，(56.38±9.82)％，(53.62±6.08)％。2．MMP-9 ASODN对A549细胞存活率抑制呈浓度和时间依赖性(反义寡核苷酸浓度为600nmol／L作用48 h时抑制作用最明显)。3．600nmol／L MMP-9ASODN作用48h，经RT-PCR扩后，MMP-9mRNA的相对表达量为0.573±0.071，明显低于其他三组0.924±0.044，0.863±0.054，0.765±0.072。4．600nmol／L MMP-9ASODN作用48h，经Western检测后，MMP-9蛋白表达水平0.53±0.068，明显低于其他三组0.76±0.052，0.79±0.075，0.81±0.126。5．MMP-9ASODN转染A549细胞后，G1期细胞数明显增多，S期细胞数相对减少，G2期细胞数则无明显变化，提示MMP-9ASODN可能延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡。MMP-9ASODN转染A549细胞后，A549细胞凋亡百分比明显高于其他三组。6．粘附实验表明MMP-9ASODN转染A549细胞后显著降低其粘附力，粘附率为(15.21±0.81)％，低于其他三组(38.92±1.23)％，(36.55±2.32)％及(32.61±1.41)％，差异有显著性。(p＜0.01)。7．划痕法迁延实验表明MMP-9ASODN转染A549细胞后其迁延力显著降低，迁延细胞数为74.09±4.48个，显著低于其他三组124.18±9.77个，120.14±8.50个及112.82±9.87个(p＜0.05)。8．MMP-9ASODN组肿瘤生长指数为3.20±0.14，明显低于其它三组5.93±0.20，5.87±0.02及6.40±0.33(P＜0.01)。MMP-9ASODN组的肿瘤重量为1.25±0.03，明显低于其它三组2.15±0.07，2.31±0.04及2.43±0.04(P＜0.01)，MMP-9ASODN组的抑瘤率为(33.41±1.18)％，而且心肝肾组织观察，结构均基本正常，未见有明显的组织损伤改变。结论1．MMP-9ASODN能够有效地抑制肺癌A549细胞的体外增殖，作用方式呈时间及浓度依赖性。2．MMP-9ASODN能够下调MMP-9mRNA和MMP-9蛋白的表达。3．MMP-9ASODN通过影响肺癌A549细胞增殖周期的分布及促进A549细胞凋亡，从而抑制A549细胞增殖。4．MMP-9ASODN在体外能够降低A549细胞粘附及迁移能力5．MMP-9ASODN瘤体注射可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长，且安全，无不良反应。