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肝纤维化是一众因素如乙型或丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、血吸虫病及药物损害引起的慢性肝损伤的常见结果,随着肝纤维化的发生发展最终可导致肝硬化甚至肝细胞性肝癌。静息态肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）的活化是肝纤维化发生的中心环节,HSCs一旦被激活将导致细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度积聚进而导致肝纤维化。因此,抑制HSCs的活化是治疗肝纤维化的首选靶点。CB1和CB2是具有相反活性的两种大麻素受体（cannabinoid receptor,CBR）,它们均在HSCs中表达,在慢性肝病中起重要作用,CB1促肝纤维化而CB2抗肝纤维化。其中CB1受体的基因或药理学失活可以通过减少HSCs关键激活因子转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）来抑制HSCs的活化进而抑制肝纤维发生。因此,CB1大麻素受体拮抗剂可能是治疗肝纤维化的新策略。本实验采用的罗通定（rotundine）是从中药延胡索中提取的生物碱延胡索乙素（tetrahydropalmatine,消旋四氢巴马汀）的有效部分即左旋延胡索乙素（levo-tetrahydropalmatine,L-THP）,具有镇痛、镇静及安定等作用,此外,其对四氯化碳所致小鼠肝损伤和Con A（concanavalin A）诱导的急性自身免疫性肝损伤均具有保护作用。但Rotundine对肝纤维化的影响尚不明确。因而,本实验体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,使用Rotundine处理HSC-T6细胞从而探讨Rotundine对肝纤维发生的影响并进一步阐明其作用机制。目的:本研究旨在探讨罗通定对肝纤维发生的影响,并初步阐明其通过下调CB1/TGF-β1/Smad3信号通路发挥抑制肝纤维发生的作用机制。为罗通定治疗肝纤维化提供新的理论依据。方法:1.体外培养HSC-T6细胞,MTT法测定不同作用浓度和时间下Rotundine对HSC-T6细胞增殖的影响,根据实验结果筛选出最佳的作用浓度和时间,求出其抑制HSC-T6细胞增殖的IC50。比色法检测HSC-T6细胞培养液中LDH的活性以评价药物的细胞毒性。酶消化法测定HSC-T6细胞培养液中羟脯氨酸（Hyp）的含量以评价药物对胶原蛋白分泌的抑制作用。细胞免疫荧光法检测CB1在HSC-T6中的表达情况。Western blot法检测collagenⅠ和α-SMA蛋白表达水平以证明药物抑制HSC-T6细胞活化和胶原合成的情况。2.体外培养HSC-T6细胞,实验分为空白对照组（Control组）、Rotundine中浓度组（62.5μM）、Rotundine高浓度组（125μM）、利莫那班（rimonabant,Rimo）+Rotundine中浓度组和Rimo组。其中利莫那班是CB1受体特异性阻断剂。Western blot法检测α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平。3.体外培养HSC-T6细胞,实验分为空白对照组（Control组）、Rotundine中浓度组（62.5μM）、Rotundine高浓度组（125μM）、花生四烯酰环丙酰胺（arachidonoyl cyclopropylamide,ACPA）+Rotundine高浓度组和ACPA组。其中ACPA是CB1受体特异性激动剂。Western blot法测定α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平。结果:1.与Control组比较,Rotundine作用于HSC-T6细胞可以明显抑制细胞增殖,以作用浓度为31.25μM、62.5μM和125μM及时间为48 h时作用最佳（P<0.05）且浓度越高抑制作用越强,具有一定程度的剂量依赖性。2.与Control组比较,低、中、高浓度的Rotundine处理HSC-T6细胞48 h后,羟脯氨酸（Hyp）含量显著降低（P<0.05）,并且随着Rotundine浓度的增加,羟脯氨酸含量越低。不同浓度Rotundine作用于HSC-T6细胞48 h后,与Control组比较,各Rotundine给药组细胞培养液中LDH活性并无显著性差异（P>0.05）,这证明Rotundine对HSC-T6细胞增殖的抑制作用及其对各指标的影响不是其非特异性药物细胞毒性所致。3.与Control组比较,低中高浓度的Rotundine处理HSC-T6细胞48 h后可以显著下调HSC-T6细胞内α-SMA和collagenⅠ蛋白表达水平（P<0.05）,这证明Rotundine可以通过抑制肝星状细胞活化和胶原的合成来抑制纤维发生。4.与Control组比较,低中高浓度的Rotundine处理HSC-T6细胞48 h后可以下调HSC-T6细胞内CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞免疫荧光结果证明CB1在HSC-T6细胞胞浆中表达。5.与Control组比较,中高浓度Rotundine处理组和Rimo组可以抑制HSC-T6细胞增殖、降低Hyp含量并下调α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。Rimonabant可以显著下调HSC-T6细胞内CB1蛋白表达。分别与中浓度Rotundine组和Rimo组比较,中浓度Rotundine+Rimo组可以显著抑制HSC-T6细胞增殖、降低Hyp含量并下调α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平（P<0.05）。6.与Control组比较,中高浓度Rotundine处理组可以显著抑制HSC-T6细胞增殖并下调α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平（P<0.05）。ACPA可以显著上调HSC-T6细胞内CB1蛋白表达。与高浓度Rotundine组比较,高浓度Rotundine+ACPA组可以逆转高浓度Rotundine对HSC-T6细胞增殖的抑制作用和高浓度Rotundine对α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平的降低作用,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.Rotundine可以抑制HSC-T6细胞的增殖活化,同时可以减少HSC-T6细胞生成分泌胶原蛋白,从而发挥其对肝纤维发生的抑制作用,并且此效应并非是由Rotundine的药物细胞毒性所致。2.下调CB1表达可以显著增强Rotundine对HSC-T6细胞增殖及胶原合成的抑制作用和Rotundine对α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平的降低作用。并且上调CB1表达可以明显逆转Rotundine对HSC-T6细胞增殖及胶原合成的抑制作用和Rotundine对α-SMA、collagenⅠ、CB1、TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平的降低作用。因此,Rotundine至少有一部分是通过下调CB1/TGF-β1/Smad3信号通路抑制HSC-T6细胞的增殖活化、减少胶原蛋白的生成和分泌进而抑制肝纤维发生。