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梨(Pyrus spp)是世界上重要的落叶果树之一,味美多汁,营养丰富。但梨的果肉中含有石细胞,较多的石细胞影响了食用口感,降低了梨的品质和价值。‘二十世纪’和‘金二十世纪’梨均属砂梨品种,品质优良。‘金二十世纪’是通过对‘二十世纪’进行辐射诱变而培育的品种,成熟后果皮呈金黄色,而‘二十世纪’果皮呈黄绿色。此外,‘金二十世纪’梨比‘二十世纪’口感更佳细腻,石细胞含量更少,是研究梨石细胞和果皮色泽的理想试验材料。本文以‘二十世纪’和‘金二十世纪’梨为试材,对两者石细胞含量、木质素含量和果皮色素成分进行测定,并对花后60天和花后150天两个时期的果实进行转录组测序,建立梨果实转录组数据库,在此基础上,筛选与梨果实石细胞和果皮色泽形成相关的基因,并通过实时荧光定量PCR技术进行验证,旨在探究梨果实石细胞含量和果皮色泽差异的生理与分子机制,为深入研究梨石细胞及果皮色泽的分子调控奠定基础。主要研究结果如下:1.比较了‘二十世纪’和‘金二十世纪’梨不同发育时期果实石细胞和果皮色素含量的差异。对“二十世纪”和‘金二十世纪’梨果实六个发育时期(花后20、40、60、80、100和150天)石细胞的数量、形态和分布进行比较,结果表明:两个梨品种石细胞含量的变化趋势相同,但达到峰值的时期不同。‘二十世纪’梨石细胞总量和石细胞团的数量在各个时期均高于‘金二十世纪’。尤其是在果肉中部,‘二十世纪’梨中石细胞的含量显著高于‘金二十世纪’。对转色期(花后100天)和成熟期(花后150天)两个时期果皮中叶绿素、类胡萝卜素和黄酮类物质含量进行测定比较发现,两个梨品种果皮颜色差异与叶绿素含量有关,与类胡萝卜素和黄酮类物质含量无直接联系。2.分析了梨果实木质素含量与石细胞含量及果皮色泽差异的关系。对“二十世纪”和‘金二十世纪’梨果实六个时期(花后20、40、60、80、100和150天)的果肉和果皮中木质素含量进行了测定和分析。结果表明,两种梨果肉中木质素含量的变化趋势一致,‘二十世纪’梨中的木质素含量均高于‘金二十世纪’梨,这一现象与两者石细胞含量差异的变化规律一致,说明木质素含量与梨石细胞形成直接相关;‘金二十世纪’梨果皮中木质素的含量在各个时期均高于‘二十世纪’,表明‘金二十世纪’梨果皮表面木栓化程度可能更高,木栓层的聚集程度不同导致了两个梨品种果皮色泽的差异。此外,木质素分布的不同可能是导致两个梨品种品质差异的重要因素。在果实发育初期,梨果实木质素不断累积,在‘二十世纪’中木质素更多的存在于果肉中,进而形成更多的石细胞,而在‘金二十世纪’中木质素更多的存在于果皮中,从而导致果皮颜色的变化。3.建立了梨果实发育转录组数据库。通过Illumina HiSeq平台对‘二十世纪’和‘金二十世纪’梨花后60天(分别标记为TCS1和GTCS1)和花后150天(分别标记为TCS2和GTCS2)的果实进行测序,平均每个样产出6.76Gb的数据。样品比对基因组的平均比对率为68.46%,比对基因集的平均比对率为69.74%。共检测到基因33,054个,其中已知的基因为31,063个,预测的新基因为2,050个。检测出的SNP和INDEL位点大都出现在外显子中,少量出现在内含子中。根据个样品基因表达水平,对差异表达基因进行筛选,在TCS1-VS-GTCS1中,共有3282个DEG(1291个上调,1991个下调);在TCS2-VS-GTCS2中,共有6885个DEG(1729个上调,5156个下调)。GO功能注释显示,可将6885个DEG划分为50个功能组。KEGG生物通路分类及富集结果显示,5801个DEG归属于六大类代谢途径。对差异表达基因转录因子编码能力进行预测和分类,2746 个转录因子归属于 MYB、MYB-related、AP2-EREBP、bHLH、NAC、WRKY等基因家族,其中归属于MYB或MYB-related基因家族的差异基因最多。4.筛选出了 4个与梨石细胞发育密切相关的基因并进行了荧光定量验证。根据GO注释和KEGG代谢通路富集结果,我们从前期的转录组数据中筛选出12个可能与梨石细胞相关的DEG(4个转录因子,8个结构基因)。结合荧光定量验证,最终筛选出4个与梨果实石细胞发育相关的关键基因。其中Myb4-like基因的表达趋势与两个梨品种石细胞差异的变化趋势相一致,说明Myb4-like基因可能正调控梨石细胞的形成;长春碱合酶-like表达趋势与梨果肉中木质素含量的变化趋势一致,KEGG代谢通路显示该基因注释到苯丙烷类代谢途径的莽草酸循环中,推测长春碱合酶可能是通过催化羟基肉桂酰CoA与三种常规木质素单体发生酰基化反应,从而促进木质素单体的合成,进而导致石细胞含量的不同;POD42-like和POD16-like两个基因在两种梨果肉中的表达量变化与木质素含量变化趋势一致,且在‘二十世纪’梨中高于‘金二十世纪’梨,推测它们通过在果实发育前期的高表达,促进木质素单体的聚合。