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干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)是一种重要的干扰素刺激基因,在机体抗病毒和抗炎等方面发挥重要作用,能抑制多种病毒感染,包括囊膜病毒和非囊膜病毒,如IAV、HIV-1和呼肠弧病毒等。然而这些病毒几乎都是RNA病毒,对DNA病毒抑制作用却少有报道。而且目前为止还未有山羊IFITM3基因组织特异性表达和分布数据,这严重妨碍了山羊病毒性疾病发生机制的研究。因此本研究对海南黑山羊IFITM3基因进行了克隆和序列分析,利用原核表达系统表达IFITM3蛋白并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过RT-qPCR和免疫组织化学研究海南黑山羊各个组织中IFITM3基因mRNA相对表达情况和IFITM3蛋白分布情况,构建IFITM3过表达和抑制表达OFTu细胞模型,研究了IFITM3蛋白在ORFV感染中的作用。研究内容如下:海南黑山羊IFITM3基因的克隆及序列分析以海南黑山羊肝脏总RNA为模板,使用RT-PCR扩增海南黑山羊IFITM3基因,将基因序列提交到GenBank,获得登录号KM236557。运用生物分析软件对海南黑山羊IFITM3序列进行了分析,结果显示,所克隆的山羊IFITM3基因表现出种属内保守性和种属间差异性,编码147个氨基酸,蛋白分子量约为15.6 kDa,存在两个潜在跨膜区,不含信号肽。海南黑山羊IFITM3蛋白原核表达与多抗制备以pMD18-T-IFITM3质粒为模板,设计特异性引物,扩增含EcoR I和Xho I酶切位点的基因片段,构建pET-32a(+)-IFITM3原核表达质粒。将构建成功的表达质粒转化至表达细菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-Blot分析,结果显示IFITM3蛋白成功诱导表达。将纯化后的蛋白与佐剂混合免疫新西兰大白兔,制备兔抗山羊IFITM3多克隆抗体。间接ELISA法和Western blot检测,结果表明制备的多克隆抗体效价高特异性好。海南黑山羊IFITM3基因和蛋白的组织特异性表达和分布研究以海南黑山羊各组织中总RNA为模板,运用RT-qPCR方法检测各个组织中IFITM3基因mRNA相对表达情况。结果显示IFITM3基因在山羊的各组织中均有表达。其中在心脏中表达量最高,显著高于其他各检测组织(P<0.05),而在大脑和胸腺中表达量最低(P<0.05)。利用制备的IFITM3多克隆抗体,应用免疫组织化学技术对IFITM3蛋白在海南黑山羊各个组织的分布进行研究。结果表明,IFITM3在心肌细胞、肝细胞、脾脏网状内皮细胞、肺支气管上皮细胞、肾小管上皮细胞、大脑皮质、胸腺髓质、肠系膜淋巴结皮质淋巴细胞、胃底腺细胞和肠腺细胞均有分布。IFITM3真核过表达载体和RNAi干扰载体构建以pMD18-T-IFITM3质粒为模板,设计特异性引物,扩增含Bgl II和Sal I酶切位点的基因片段,构建pEGFP-N1-IFITM3真核过表达质粒。将p EGFP-N1-IFITM3转染OFTu细胞,经荧光显微观察和Western-Blot检测,结果显示成功构建过表达载体,实现IFITM3在OFTu细胞中过表达。设计IFITM3基因寡核苷酸引物,构建pSUPER-IFITM3干扰载体。将pSUPER-IFITM3转染OFTu细胞,荧光显微观察和Western-Blot检测,实现了IFITM3在OFTu细胞中的沉默表达,24h内IFITM3蛋白抑制效率达67%。IFITM3在ORFV感染宿主细胞中抗病毒作用研究利用荧光定量PCR对ORFV感染OFTu细胞不同时段(0、2、4、6、12、24、36、48、72h)IFITM3基因表达情况进行分析;将ORFV分别感染IFITM3过表达和抑制表达的OFTu细胞,收集不同时段(6、12、24、36、48、72h)病毒液,检测病毒滴度并绘制病毒生长曲线。结果表明,IFITM3基因在病毒感染早期表达量上调,在感染后4h mRNA表达量最高;过表达IFITM3的OFTu细胞中不同时间点的病毒滴度显著低于对照组,抑制表达IFITM3的病毒滴度略高于对照组,表明山羊IFITM3蛋白对ORFV病毒的增殖具有重要作用。