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拟南芥AtWNK9基因属于WNK基因家族,本研究先利用生物信息学的方法对AtWNK9蛋白结构、磷酸化位点、启动子顺式作用元件、基因组织器官表达模式进行了分析。结果显示AtWNK9属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族,存在多个磷酸化位点,启动子区域含有多个激素和非生物胁迫响应元件,且AtWNK9基因主要在根中表达,定位在细胞核内。
构建了AtWNK9过量表达载体,并转化拟南芥获得了AtWNK9过量表达株系;鉴定AtWNK9基因的T-DNA插入突变体,获得了wnk9缺失突变体纯合子。拟南芥原生质体转化实验证明AtWNK9定位在细胞核,实时定量PCR和GUS染色实验,发现AtWNK9基因在拟南芥根中高效表达。
用ABA(100μM)、盐(300mM)、葡萄糖(2%)、热(37℃)、冷(4℃)处理14天大的野生型拟南芥,定量分析AtWNK9基因表达量,发现AtWNK9基因的表达量受ABA、NaCl、葡萄糖、热和冷等激素及非生物胁迫的诱导,其中ABA的诱导效果最明显;外源ABA处理时,AtWNK9的过量表达和功能缺失突变体与野生型相比,在主根伸长、气孔开度、失水率、脯氨酸含量等方面都存在明显差异,AtWNK9过表达突变体相对于野生型Co(l)-4对ABA超敏感,而功能缺失突变体wnk9相对于野生型Co(l)-0对ABA不敏感。
对过量表达植株AtWNK9ox3、AtWNK9ox4、AtWNK9ox7和缺失突变体wnk9进行10~12天的干旱处理,发现过表达突变体的抗干旱能力明显比野生型强,而功能缺失突变体的抗干旱能力比野生型弱。
定量PCR分析发现,外源ABA处理后,RAB18、RD22、ABI3和ABF3在过表达突变体AtWNK9ox3中表达量比野生型Co(l)-4中高,而在功能缺失突变体wnk9中,表达量比野生型Co(l)-0低;ABI1、ERA1在过表达突变体AtWNK9ox3中表达量比野生型Co(l)-4低,而在功能缺失突变体wnk9中表达量比野生型Co(l)-0高。
综上所述,拟南芥AtWNK9通过影响ABA信号通路中相关基因的表达量,作为正调节子参与ABA的信号转导,增强了拟南芥的抗干旱能力。