前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是一种雄激素依赖性肿瘤,雄激素可刺激前列腺癌细胞生长和疾病进展。传统的前列腺癌内分泌治疗包括阻断睾丸雄激素的雄激素剥夺疗法（ADT）和阻断肾上腺雄激素的抗雄激素疗法。目前前列腺癌内分泌治疗主要是抑制雄激素/雄激素受体（AR）信号。然而,由于肿瘤内雄激素合成增加和AR变异,前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC）,最终对新型内分泌疗法产生耐药性。因此,迫切需要寻找新的前列腺癌治疗方向和策略。脂质异常积聚在许多肿瘤细胞中,如透明细胞肾癌、乳腺癌和前列腺癌。最近的研究表明前列腺癌细胞的脂质积累与CRPC和新型内分泌治疗耐药的发生密切相关。然而,有效减少前列腺癌中脂质积累的方法尚不清楚。本研究通过筛选脂质代谢相关基因,并在前列腺癌数据库中进行生物信息学分析,确定了前列腺癌中脂质代谢相关的关键基因ACSS3。通过体外及体内实验探究ACSS3调控脂滴包被蛋白PLIN3在CRPC的发生发展、脂质代谢以及新型内分泌治疗耐受中的作用,并在基因和蛋白水平上研究ACSS3调节PLIN3的具体调控机制。为进一步了解前列腺癌进展期脂质代谢异常以及CRPC治疗的研究提供新的策略。本课题总共分为以下四部分:第一部分:脂代谢相关基因在前列腺癌中的筛选及其表达分析目的:在前列腺癌和癌旁基因表达数据中明确关键的脂代谢相关基因,探讨目的基因在前列腺癌中的表达情况及临床相关性。方法:收集TCGA和GEO数据库中前列腺癌生物信息数据,根据Oncomine数据库中脂代谢相关基因集,筛选出具有癌与癌旁具有显著统计学差异的关键基因,进一步明确目标基因与前列腺癌肿瘤病理分期、Gleason评分、预后等临床信息的相关性。运用组织免疫化学染色的实验方法（Immunohistochemistry,IHC）检测前列腺癌临床样本中目标基因的表达情况。通过公共数据库预测ACSS3启动子区域Cp G岛位置及其甲基化程度;在数个PCa细胞系及临床前列腺癌组织样本中,通过亚硫酸盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）分析检测ACSS3 Cp G岛甲基化程度,甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）验证不同PCa细胞系中ACSS3启动子的甲基化位,通过凝胶电泳、实时定量PCR探索ACSS3启动子甲基化程度与基因低表达是否相关。结果:通过在5个独立的PCa数据库（TCGA、Taylor、Lapointe、Tomlins、Grasso）中筛选脂代谢相关基因集,筛选出4个基因（ACSS3、ACSF2和CLU在前列腺癌中表达下调,FABP5在前列腺癌中表达上调）（|Log FC|>1.5,p<0.05）。只有ACSS3与前列腺癌患者的临床无病生存时间（DFS）和无复发生存时间（BCR）相关:表达高水平ACSS3的肿瘤患者比表达低水平ACSS3的肿瘤患者有更长的DFS（p=0.0007）和BRFS（p=0.0072）。且前列腺癌低表达ACSS3 m RNA水平与肿瘤分期、Gleason评分和生化复发相关（p<0.05）。IHC结果显示前列腺癌组织（n=371）的ACSS3蛋白水平明显低于正常组织（n=107）。ACSS3低表达与肿瘤分期和Gleason评分呈正相关。ACSS3启动子区域富含Cp G岛,前列腺癌组织及细胞中ACSS3 Cp G岛的甲基化程度明显高于前列腺正常组织和正常上皮细胞。ACSS3的Cp G岛甲基化程度与其表达水平负相关。结论:ACSS3在前列腺癌中表达下调,表达水平与前列腺癌进展和临床预后相关。ACSS3表达缺失是基因启动子甲基化引起的。第二部分:ACSS3对前列腺癌细胞生物学行为的影响目的:探索ACSS3对前列腺癌细胞生物学行为的影响。方法:运用慢病毒构建稳定过表达ACSS3前列腺癌细胞系和稳定敲除ACSS3前列腺癌细胞系,采用CCK8、Transwell检测ACSS3过表达/敲除后对前列腺癌细胞系增殖和迁移能力的影响;采用非靶向脂质组学、油红染色的方法检测ACSS3对细胞内脂质含量的影响。对表达ACSS3前列腺癌细胞系和对照组前列腺癌细胞系进行转录组测序,并通过qt-PCR、western blot等方法验证,探讨ACSS3对前列腺癌生物学行为作用的调控机制。结果:过表达ACSS3明显抑制前列腺癌细胞的生长、迁移能力,减少肿瘤细胞内的脂质;敲除ACSS3的作用相反。进一步研究发现,ACSS3通过促进内质网应激,介导前列腺癌细胞凋亡。结论:ACSS3抑制前列腺癌细胞内异常脂质积聚,促进内质网应激,介导前列腺癌细胞凋亡,抑制细胞生长。第三部分:ACSS3介导脂滴相关蛋白PLIN3蛋白稳定性目的:研究ACSS3降低前列腺癌细胞内脂滴堆积的机制方法:通过Western blot、qt-PCR检测过表达/敲除ACSS3前列腺癌细胞内脂滴相关蛋白PLIN2、PLIN3的表达情况;在过表达/敲除ACSS3前列腺癌细胞内加入蛋白翻译抑制剂、不同途径的蛋白降解途径抑制剂,收集不同时间段的蛋白,明确ACSS3对脂滴相关蛋白PLIN3的影响;通过蛋白免疫共沉淀的方法,检测细胞内PLIN3的泛素化水平。通过在过表达ACSS3细胞系中构建稳定过表达PLIN3的前列腺癌细胞系,CCK8、Transwell、油红染色、细胞免疫荧光和Western blot检测ACSS3过表达及ACSS3过表达后回复PLIN3表达对前列腺癌细胞生长、迁移、细胞内脂质含量和内质网应激程度的影响。结果:q RT-PCR结果显示,ACSS3不影响PLIN2、PLIN3 m RNA水平;Western blot结果显示在前列腺癌细胞中过表达ACSS3导致PLIN3蛋白水平下降,但对PLIN2蛋白水平无影响。进一步研究发现ACSS3通过AIP4介导的泛素化途径影响PLIN3蛋白稳定性。与Con+NC组相比,单独过表达PLIN3或过表达ACSS3+PLIN3可促进细胞增殖和迁移、细胞内脂滴堆积,降低了细胞内质网应激程度。但与过表达PLIN3相比,过表达ACSS3+PLIN3对细胞增殖、迁移、脂滴堆积和内质网应激程度均无影响。结论:ACSS3调控PLIN3的蛋白稳定性,PLIN3挽救了ACSS3介导的肿瘤细胞抑制功能。第四部分:ACSS3抑制CRPC进展及逆转恩杂鲁胺耐药的机制研究目的:探讨ACSS3对前列腺癌进展及恩杂鲁胺耐药的影响和机制方法:在不同阶段前列腺癌细胞系模型中加入胆固醇,检测细胞的生长情况;检测CRPC细胞系模型C4-2细胞内ACSS3对瘤内雄激素合成的影响;构建恩杂鲁胺诱导的耐药细胞系C4-2-ENZR,检测细胞耐药前后ACSS3表达水平、细胞内脂质含量的变化;运用CCK8检测过表达ACSS3后耐药细胞系22RV1、C4-2-ENZR对恩杂鲁胺的敏感性;构建稳定过表达ACSS3恩杂鲁胺耐药细胞系,体内动物实验研究ACSS3对前列腺癌恩杂鲁胺耐药的影响。结果:过表达ACSS3重塑C4-2细胞对胆固醇处理的敏感性;ACSS3表达显著降低C4-2细胞中睾酮和双氢睾酮含量,且ACSS3表达的作用是通过下调PLIN3介导的。与C4-2细胞相比,C4-2-ENZR细胞的脂质含量和ACSS3表达降低,PLIN3表达增加。CCK8实验结果显示过表达ACSS3的C4-2-ENZR细胞对恩杂鲁胺的耐药性明显低于对照组的C4-2-ENZR细胞。动物实验结果同时表明ACSS3过表达逆转了前列腺癌恩杂鲁胺耐药。结论:ACSS3通过抑制瘤内激素合成,抑制CRPC进展,逆转恩杂鲁胺耐药。