【摘 要】
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目的:(1)证实人胚(妊娠10-13周)视网膜干细胞的存在,观察其分布特征;(2)探讨人胚视网膜干细胞的体外分离培养方法,并进一步鉴定其神经干细胞特性;(3)比较不同培养条件对人胚视网膜
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目的:(1)证实人胚(妊娠10-13周)视网膜干细胞的存在,观察其分布特征;(2)探讨人胚视网膜干细胞的体外分离培养方法,并进一步鉴定其神经干细胞特性;(3)比较不同培养条件对人胚视网膜干细胞体外生物学特性的影响。
方法:(1)制作人胚(妊娠10-13周)视网膜石蜡切片标本,免疫组化染色观察神经巢蛋白(Nestin)和Ki-67的表达;(2)采用机械分离联合酶学消化方法,用含10ng/ml表皮生长因子(EGF)+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,bFGF)视网膜干细胞培养液体外培养人胚视网膜干细胞(humanfetalretinalstemcells,HRSCs),倒置相差显微镜观察细胞形态变化;进行传代培养观察其自我更新能力,细胞免疫化学染色方法进一步观察Nestin的表达;用含1%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)视网膜干细胞培养液促分化培养后,观察神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、视紫红质蛋白、蛋白激酶C蛋白、β-神经微管蛋白等的表达;(3)体外培养人胚视网膜色素上皮细胞,利用人胚视网膜色素上皮细胞条件培养液(HRPE-CM)模拟体内环境,通过细胞计数方法比较不同环境条件对人胚视网膜干细胞体外生物学特性的影响,并进一步鉴定其神经干细胞特性。
结论:(1)人胚(妊娠10-13周)视网膜中存在神经干细胞,分布于原始神经上皮层全层,部分细胞处于增殖周期,且主要位于外层的原始神经母细胞层;(2)HRSCs在bFGF和EGF共同作用下能保持增殖未分化状态,具有神经干细胞特性,即表达神经干细胞特异性抗原Nestin、具有自我更新能力和多向分化潜能;(3)HRPE-CM对HRSCs的增殖能力具有明显的促进作用,并且能很好地维持其生物学特性。
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