论文部分内容阅读
目的:使用PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT信号通路,通过mi R21-5p过表达腺相关病毒载体感染大鼠肺组织,探讨高氧性急性肺损伤(HALI)中mi R21-5p可靶向PTEN,激活PI3K/Akt信号通路调控AEC-Ⅱ凋亡发挥肺保护作用。方法:200-250g SPF级雄性SD大鼠120只,分为5组(n=24):HALI组(饲养三周,建立高氧模型);LY+HALI组(饲养三周,按0.3mg/kg经尾静脉注射PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,建立高氧模型);LY+mi R21+HALI组(AAV6-mi R-21-5p载体经气管感染SD大鼠肺并饲养3周,按0.3mg/kg经尾静脉注射PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,建立高氧模型);mi R21+HALI组(AAV6-mi R-21-5p载体经气管感染SD大鼠肺并饲养3周,建立高氧模型);DMSO+HALI组(饲养三周,0.5%DMSO经尾静脉注射,建立高氧模型)。在0h、24h、48h和60h时间点取相关实验标本,检测下列肺损伤相关指标:1)采颈动脉血检测氧合指数(OI)和呼吸指数(RI);2)取完整左肺上叶测量肺湿/干(W/D)重比;3)取左肺下叶行HE染色并采用国际标准行标准化肺损伤病理评分;4)使用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测各实验组AEC-II mi R21-5p相对表达水平;5)采用蛋白质印迹法(Western blot)技术检测各实验组AEC-II PI3K、PTEN及AKT/p-AKT蛋白相对表达水平;6)使用Annexin V-FITC/PI双染色法通过流式细胞术(FCM)检测AEC-Ⅱ的凋亡。结果:1.氧合指数(OI)及呼吸指数(RI):各组大鼠OI随时间点增长逐渐降低,RI随时间点增长逐渐升高(p<0.05)。在24h、48h及60h时间点,LY+HALI组与HALI组比,OI明显降低而RI明显升高(p<0.05);mi R21+HALI组与其他4组比,OI明显升高而RI明显降低(p<0.05)。2.湿干(W/D)重比:各实验组湿干(W/D)重比随时间点增长逐渐升高;在48h及60h时间点,LY+HALI组较HALI组W/D重比升高明显(p<0.05);mi R21+HALI组较其他4组W/D重比明显降低(p<0.05)。3.HE染色:0h时间点,肺间质偶见2-3个中性粒细胞;24h时间点,各组肺间质均可见中性粒细胞,LY+HALI组中性粒细胞增多最为明显并可见肺间质增厚;48h时间点,各组肺泡及肺间质可见大量中性粒细胞并肺间质增厚,LY+HALI组可见蛋白质碎片及透明膜;60h时间点,除mi R21+HALI组外,其他4组肺泡均可见蛋白质碎片及透明膜,肺泡间质明显增厚,尤以LY+HALI组最为明显。4.标准化肺损伤病理评分:各组病理评分随时间点延长逐渐升高,在0h时间点,各组病理评分无明显变化(P>0.05);LY+HALI组在24h、48h及60h时间点病理评分较其他组明显升高(P<0.05);mi R21+HALI组在24h、48h及60h时间点病理评分较其他4组明显降低(P<0.05)。5.流式细胞术检测AEC-Ⅱ凋亡:各组ACE II凋亡率随时间点逐渐升高;在0h时间点,各组凋亡率无明显变化(p>0.05);在24h、48h及60h时间点,与HALI组比,LY+HALI组AEC-II凋亡率明显升高(P<0.05);mi R21+HALI组较其他4组AECII组凋亡率明显降低(P<0.05)。6.RT-q PCR检测mi R21-5p水平:HALI组、LY+HALI组及DMSO+HALI组的24h、48h及60h时间点与0h时间点比较,mi R21-5p表达水平明显降低(P<0.05);LY+mi R21+HALI组合mi R21+HALI组,在0h、24h、48h及60h时间点mi R21-5p表达水平无明显变化(P>0.05)。7.Western blot检测相关蛋白表达结果:在24h及48h时间点,mi R21+HALI组pAKT明显升高(p<0.05),LY+HALI组p-AKT明显降低(p<0.05);在60h时间点,除mi R21+HALI组p-AKT明显升高外,其他组未见p-AKT(p<0.05);在0h、24h、48h及60h时间点,mi R21+HALI组及LY+mi R21+HALI组PTEN明显降低(p<0.05),LY组及LY+mi R21+HALI组PI3K明显降低(p<0.05)。结论:在HALI动物模型中,mi R21-5p可通过靶向PTEN激活PI3K/AKT信号通路调控AEC-II凋亡减轻HALI的发生发挥肺保护作用。