研究背景:根据WHO在2020年发布的最新数据显示,乳腺癌（breast cancer,BC）已超过肺癌,成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤。预计在2021年底,将有超57万名女性被新确证为乳腺癌,将有超过9万名女性死于乳腺癌。近年乳腺癌的治疗手段不断的更新迭代,无论在化疗方案的多样性,还是手术方式更新和放射治疗,尤其是靶向治疗、内分泌治疗及免疫治疗等不断进步,都为乳腺癌患者带来了更多的获益,大大延长了患者的总生存率和无疾病复发时间,尽管如此,但仍有30%40%的患者因复发转移而死亡。寻找更多乳腺癌的有效治疗靶点,提高乳腺癌的防治效果一直是一个重大的医学研究课题。恶性肿瘤的发生发展、转移通过恶性细胞的不断增殖来实现的,细胞增殖包括4个细胞周期,在这4个细胞周期中,大量的基因参与其中。本研究团队在之前的研究中,通过比较两对乳腺癌耐药组织标本中的转录差异基因,筛选出候选基因——DYNLT1。DYNLT1基因编码的动力蛋白轻链Tctex 1,是细胞质中动力蛋白复合物的几个非催化辅助成分之一,主要参与将动力蛋白连接到货物和调节动力蛋白功能的适配器蛋白中,为囊泡和细胞器提供马达,使其沿着微管在细胞内逆行运动。研究表明,DYNLT1蛋白可参与多种细胞功能,包括膜细胞器的运输,有丝分裂纺锤体定向,核迁移和细胞迁移等。但DYNLT1在乳腺癌中的作用尚未见报道。为进一步探讨DYNLT1在乳腺癌中的作用,本研究拟拟在细胞、动物及临床组织等多个层面,通过基因编辑干预DYNLT1的表达,观察DYNLT1对乳腺癌细胞生长周期从而影响癌细胞对化疗药物紫杉醇敏感性,为寻找乳腺癌治疗新的靶点提供思路。研究方法:1.利用公共平台的生物信息学数据,通过生物信息分析了解DYNLT1表达与临床预后指标（如OS、RFS）的相关性。2.通过慢病毒sh RNA系统构建稳定敲低DYNLT1的ZR 75-30、BT 549乳腺癌细胞株;通过转染过表达载体构建过表达DYNLT1的MDA-MB-231乳腺癌细胞株。3.通过CCK8和克隆形成来检测敲低及过表达DYNLT1后,乳腺癌细胞增殖能力的变化;通过流式分析来检测同步化后再释放,不同时间点（0h、4h、8h、12h、18h和24h）细胞周期的改变;采用q RT-PCR和WB实验检测细胞周期调控蛋白的变化。4.在敲低及过表达DYNLT1的乳腺癌细胞中,分别给予各周期抑制剂（thymidine、hydroxyurea、mimosine、nocodazole）处理,流式分析检测细胞周期的变化,q RT-PCR和WB实验检测细胞周期调控蛋白的表达。5.在敲低及过表达DYNLT1的乳腺癌细胞中,给予周期特异性化疗药物——紫杉醇,通过CCK8实验检测干预DYNLT1表达后细胞对紫杉醇药物毒性的变化;通过流式细胞仪检测细胞凋亡,WB实验检测相关凋亡蛋白表达。6.通过免疫共沉淀收集蛋白并进行质谱分析,分析在DYNLT1表达水平不同状态下,与DYNLT1结合的蛋白表达与细胞周期的关系。7.构建敲低或过表达DYNLT1的乳腺癌细胞原位裸鼠脂肪垫成瘤模型,待瘤体长到100mm3后,将裸鼠分成两组,给药组及未给药组,给药组根据体重腹腔注射紫杉醇（Paclitaxel浓度为1.2mg/ml,10ul/g）,隔2天给药一次。测量并记录裸鼠体重及肿瘤生长情况。瘤体收集后,免疫组化检测各组瘤体中DYNLT1、KI67及周期和凋亡通路相关蛋白的表达。8.收集乳腺癌患者的临床基本资料、病理资料及随访资料,结合免疫组化结果从临床层面分析DYNLT1的表达与乳腺癌临床特征的相关性。结果:1.通过对公共数据库TCGA的数据分析,发现在包括乳腺癌在内的大多数肿瘤中,DYNLT1在正常组织中的表达要明显低于肿瘤组织;同时,生存曲线分析发现,在乳腺癌中,高表达DYNLT1显著缩短患者的总生存时间（P<0.001）和无疾病复发时间（P<0.001）。2.通过CCLE（https://portals.broadinstitute.org/ccle）数据检测DYNLT1在不同亚型乳腺癌细胞株中的表达,结果发现,DYNLT1在ZR 75-30和BT 549乳腺癌细胞株中表达量较高,而在MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达较低。在ZR 75-30和BT 549细胞中分别感染DYNLT1 sh RNA慢病毒。q RT-PCR和WB结果发现,ZR 75-30DY-SH及BT 549 DY-SH细胞中DYNLT1的表达量较对照细胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）分别降低了80.3%±5.7%（p<0.01）、83.2%±2.7%（p<0.01）;同时,在MDA-MB-231细胞中转染DYNLT1过表达载体,q RT-PCR和WB结果发现MDA-MB-231 DY-Flag细胞中DYNLT1的表达量较对照组细胞MDA-MB-231NC-Flag升高2.0±0.2倍（p<0.01）。这些结果提示敲低及过表达DYNLT1的稳定细胞株构建成功CCK8增殖实验和平板克隆实验表明:与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后明显抑制ZR 75-30 DY-SH及BT 549 DY-SH细胞的增殖能力;而过表达DYNLT1后,MDA-MB-231 DY-Flag细胞的增殖能力则明显强于对照组细胞（MDA-MB-231 NC-Flag）。3.通过流式细胞系分析发现,与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,同步化后释放24h,G2/M期的比例为7.60%,显著低于对照组的20.30%（p<0.01）;通过给予不同周期抑制剂后发现,与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,给药后,G2/M的比例为14.89%,显著低于对照组的35.46%（p<0.01）。4.通过IP实验将与DYNLT1结合的蛋白进行质谱分析,结果发现与DYNLT1结合的蛋白G2/M期细胞周期调节通路中富集最多。5.CCK8检测发现,敲低DYNLT1的稳定株较对照组细胞对紫杉醇药物（PTX）的敏感性增加,ZR 75-30细胞的IC50分别为:对照组10 ug/ml及敲低组4.5 ug/ml,流式细胞仪检测细胞凋亡也发现,在相同药物浓度下,DYNLT1敲低后与对照组细胞相比,细胞凋亡数量增多（ZR 75-30细胞在7.2 ug/ml时对照组与敲低组凋亡细胞比例分别为66%及82%,p<0.05）;BT 549细胞的IC50分别为:对照组12.5 ug/ml及敲低组6.0 ug/ml,流式细胞仪检测细胞凋亡也发现,在相同药物浓度下,DYNLT1敲低后与对照组细胞相比,细胞凋亡数量增多(BT 549细胞在5.4 ug/ml时对照组与敲低组凋亡细胞比例分别为（17.7%及45.8%,p<0.05）。6.体内实验表明:在脂肪垫原位成瘤模型中,敲低DYNLT1后,肿瘤的生长速度明显低于对照组;无论是对照组还是DYNLT1敲低组,给予紫杉醇腹腔注射后,肿瘤的生长速度均较未给药组明显减慢,但DYNLT1敲低组的瘤体缩小比例显著大于对照组（p<0.01）。免疫组化实验（IHC）结果显示:裸鼠瘤体组织中,DYNLT1敲低组细胞中,DYNLT1的蛋白表达明显低于对照组;同时,DYNLT1敲低组中Ki67表达相较于对照组明显减少,在未给药组中可以发现,Caspase3、Bcl2等相关凋亡蛋白在敲低组和对照组中无明显差别,给予紫杉醇干预后,敲低DYNLT1组凋亡蛋白Caspase3表达明显增高,而抗凋亡蛋白Bcl2在敲低组明显减少。7.通过对33例乳腺癌临床标本进行免疫组化染色,其中PR组共11例,SD组共10例,PD组共12例,结果显示在PR组比例为9%,SD组高表达DYNLT1的乳腺癌比例为30%,PD组比例为83.3%。结论:1.DYNLT1在乳腺癌中呈高表达,其表达与乳腺患者的总生存时间以及无疾病复发时间呈负相关。2.DYNLT1主要通过影响细胞周期G2/M期促进乳腺癌细胞增殖。3.高表达DYNLT1显著削弱乳腺癌细胞对M周期特异性化疗药紫杉醇的化疗敏感性。