青冈栎单宁分离纯化及其抗疲劳、抗肿瘤活性研究

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青冈栎(Cyclobalanopsis glauca (Thunb.) Oerst.)为壳斗科(Fagaceae)青冈属(Cyclobalanopsis Oerst.)植物。青冈栎中含有大量生物活性物质,包括单宁、多糖、生物碱、多酚、VB2、VB1、VC、脂类等。本文以青冈栎果实单宁为研究对象,系统地研究了其分离提取工艺及其抗疲劳、抗肿瘤活性。采用超声波辅助提取法对青冈栎果实中的单宁进行提取,确定了其最佳提取工艺,获得青冈栎单宁。对青冈栎单宁的分离纯化进行研究,优化大孔吸附树脂分离青冈栎单宁的工艺条件。采用体内和体外评价方法研究了青冈栎单宁的抗疲劳和抗肿瘤活性,并对其作用机理进行探讨。本研究的主要结果如下:(1)对青冈栎果实的多酚类物质进行了测定,其中总多酚、总黄酮和单宁的含量分别为2.433%、0.325%和1.821%。(2)采用超声波提取法对青冈栎果实中单宁的提取工艺进行研究,利用单因素试验和响应面法试验优化青冈栎单宁的提取工艺。结果表明:①超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁的各因子对单宁提取率的影响不是简单的线性关系,各因子对单宁提取率影响的强烈程度为:超声波功率>乙醇体积分数>提取温度>液料比;②超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁的最佳提取工艺条件为:提取温度为50℃,乙醇浓度为61%,液料比为31:1,超声波功率为313W。在此条件下,青冈栎果单宁的提取率为1.978%。(3)对青冈栎单宁的分离纯化条件进行研究,研究了六种不同大孔树脂对青冈栎单宁静态和动态吸附及解吸效果,并对SP-700型大孔吸附树脂分离纯化青冈栎果单宁工艺进行优化,结果表明:①SP-700型大孔吸附树脂为青冈栎果实单宁分离纯化的理想树脂,其静态吸附率为87.32%,解吸率为85.69%;②SP-700型大孔树脂分离纯化青冈栎果单宁的最佳工艺条件为:控制上样初始浓度为0.4mg/mL,采用上样流速为1.0mL/min进行吸附,然后用70%乙醇以1.0mL/min的洗脱流速洗脱。此条件下吸附分离的单宁纯度可由原来的7.71%提高到28.76%。(4)系统地研究了青冈栎果单宁的体内外抗疲劳能力。以还原型谷胱甘肽(GSH)为对照物,通过体外和体内抗氧化模型评价了青冈栎果单宁的抗氧化活性,并在抗氧化活性分析的基础上,采用小鼠力竭游泳试验评价青冈栎果单宁抗运动性疲劳的活性,结果表明:①青冈栎果单宁具有较强的体外抗氧化作用。青冈栎果实单宁DPPH清除能力IC50值为1.73mg/mL,优于GSH的3.34mg/mL;青冈栎果实单宁对Fe3+的还原力略低于GSH,当CGFT浓度为GSH浓度的2倍左右时,两者还原力相当;青冈栎果实单宁对Fe2+具有较强的螯合力,且其螯合力随浓度的增加而增强,浓度增加至5mg/mL时螯合力可达79.82±2.03%;青冈栎果实单宁表现出较GSH强的清除O2-·能力,其清除O2-·能力的IC50值为1.03mg/mL,远优于GSH的3.67mg/mL;青冈栎果实单宁能够一定程度上抑制H2O2诱导的红细胞氧化性溶血,其抑制H2O2诱导红细胞氧化性溶血的IC50值为18.76mg/mL。②青冈栎果单宁具有较强的体内抗氧化活性,能提高小鼠体内抗氧化酶系的活力,使小鼠体内的抗氧化酶系SOD、 CAT和GSH-Px的活力分别提高了7.4%-15.3%、27.7%-56.1和26.9%-43.2%。③青冈栎果实单宁使鼠力竭游泳时间提高了30%-45%,使小鼠血糖和肝糖原的含量分别提高了23%-34%和1.9-3.4倍;青冈栎果实单宁能提高小鼠体内LDH活性,能加快清除或延缓小鼠体内乳酸和尿素氮的积累。(5)研究青冈栎果实单宁的体内外抗肿瘤作用。选用宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞H460为研究对象。采用MTT比色法测定了不同浓度的青冈栎单宁对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用。以昆明小鼠为实验动物,通过动物建模的方法,研究青冈栎单宁的体内抗肿瘤效果,结果表明:①青冈栎果实单宁对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞H460抑制作用的IC50值分别为2.402mg/mL、12.365mg/mL和14.240mg/mL;②青冈栎果实单宁能显著抑制实体瘤S180的生长,且具有剂量依赖关系,剂量为100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg的抑瘤率分别为为57.49%、41.79%和28.17%。
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