疫苗接种是防治传染性疾病的有效途径。近年来,更安全、有效的新型疫苗的研发日益受到重视。新型疫苗包括亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等,其分子小、免疫原性相对较差,难以产生有效的免疫应答,需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。目前美国FDA批准的广泛用于人群疫苗的铝盐佐剂诱导的细胞免疫较弱,对于某些新型疫苗佐剂活性较差,尤其是对于分子量小的多肽抗原无佐剂活性,不能完全满足新型疫苗发展的需要。发现和研发更安全有效的新型免疫调节剂对疫苗的发展具有十分重要的意义。Triflin是一种蛇毒CRISPs蛋白,其N端PR-1结构域与植物中具有抵抗病原感染的PR-1蛋白在空间结构上具有高度同源性,推测可能与免疫调节作用相关。本研究针对Triflin的PR-1结构域,系统进行了PR-1结构域的重组表达、免疫增效作用及作用机制研究。研究目的本研究探索Triflin蛋白PR-1结构域为基础的重组蛋白TFPR1的佐剂活性及其免疫调节机制,不但可阐明PR-1结构域的生物学功能,同时可获得一种新型佐剂,为新型疫苗的研究奠定基础,也为新型佐剂的发现、设计及研发提供新思路。研究方法(1) Triflin蛋白结构分析及重组蛋白TFPR1的制备通过对Triflin蛋白序列N端进行二级结构分析和同源建模预测,确定以该蛋白PR-1结构域为基础的重组蛋白TFPR1的对应基因序列；根据大肠杆菌密码子嗜性优化后进行人工合成并采用原核系统进行表达,诱导表达的目的蛋白TFPR1经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并分析其表达形式；利用镍柱亲和层析法纯化包涵体蛋白,采用透析法进行蛋白复性；分别利用SDS-PAGE检测蛋白纯度、Bradford法测定蛋白浓度以及鲎试剂凝胶法测定蛋白内毒素含量；分析重组蛋白TFPR1的稳定性,并以复性后TFP R1免疫BALB/c雌性小鼠,分析其在小鼠体内的生物活性。(2)重组蛋白TFPR1对蛋白和多肽抗原的免疫增强作用研究分别以经典模式抗原OVA、重组蛋白类抗原HBsAg及小分子肽类抗原HIV-1 Pep5作为模式抗原,依照一定比例简单混合后肌肉注射途径免疫BALB/c雌性小鼠,以人用铝盐佐剂为对照,ELISA法和ELISPOT法分别检测小鼠对抗原的体液免疫和细胞免疫应答情况,分析重组蛋白TFPR1的免疫增效特点；在TFPR1自身抗体存在的情况下,分析预存抗体对TFPR1佐剂活性的影响。(3)重组蛋白TFPR1增强抗原免疫应答的作用机制研究以人PBMCs为对象,开展重组蛋白TFPR1体外结合及刺激实验。利用流式细胞技术分析TFPR1结合的免疫细胞类别；利用ELISA法检测细胞样本在蛋白刺激后产生的不同细胞因子水平；进一步利用toll样受体的抗体封闭实验、NF-κB通路阻断实验探索TFPRl蛋白参与免疫调节的具体通路及机制。研究结果(1)成功设计并表达了具有生物活性的重组蛋白TFPR1。重组蛋白TFPR1为Triflin蛋白的生物信息学分析设计,具有PR-1结构域的经典结构,即α-β-α的三明治结构；TFPR1在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,经纯化复性后获得纯度95%以上的重组蛋白,复性后的TFPR1主要以单体形式存在,其次为二聚体；在未添加任何稳定剂和防腐剂的条件下,重组蛋白TFPR1在磷酸盐缓冲液中常温保存三个月仍有75%的蛋白保持稳定,说明该蛋白具有良好的稳定性；经内毒素去除,重组蛋白TFPR1的内毒素含量低于0.25 U;重组蛋白TFPR1肌肉途径免疫小鼠无需任何佐剂即可诱导机体产生较高的抗TFPR1的抗体,表明TFPR1具有自身佐剂活性。(2)重组蛋白TFPR1可显著增强蛋白类和多肽类抗原的免疫原性,同时诱导体液和细胞免疫以不同模式抗原探究重组蛋白TFPR1的佐剂活性,研究表明TFPR1具有佐剂活性,与蛋白、多肽类抗原简单混合后,可引起较强的体液和细胞免疫应答,具有Thl型偏倚的免疫应答,佐剂活性优于铝盐佐剂；重组蛋白TFPR1具有良好的安全性,不会引起免疫小鼠的不良反应；同时,在抗TFPR1抗体存在的条件下并不影响其佐剂活性。(3)重组蛋白TFPR1可能通过结合TLR4继而激活免疫细胞产生Thl型和调节型细胞因子采用现代分子生物学及免疫学实验,从细胞和分子水平对TFPR1的免疫增效机制进行研究。实验表明,重组蛋白TFPR1可结合不同类型的免疫细胞,刺激人PBMCs产生INF-γ、TNF-α及IL-10等不同类型的细胞因子；这种激活作用是剂量依赖的。继而发现,应用具有中和作用的抗人TLR4多克隆抗体封闭PBMCs后,再加入TFP R1刺激,其上清中的IFN-γ显著下降；最后,以TFPR1蛋白刺激稳定表达TLR4的293T细胞系,其IL-8显著升高,而阴性对照组则无IL-8产生,这进一步证明TFPR1免疫调节作用可能通过激活TLR4发挥作用。结论本研究构建并成功表达triflin蛋白的活性功能区TFPR1,并发现TFPR1蛋白具有良好的免疫增效作用。TFPR1只需与抗原简单混合,无需偶联,不但可以增强蛋白抗原(卵白蛋白和重组乙肝表面抗原)的免疫原性,诱导Thl偏倚的Th1/Th2体液免疫应答和细胞免疫应答；更为重要的是,TFPR1可以显著增强多肽抗原的免疫原性。重组蛋白TFP R1可能通过TLR4进而激活免疫细胞产生Thl型和调节性细胞因子发挥免疫增强作用。本研究发现了一种具有良好免疫增效作用的免疫调节分子。这不但对疫苗研发具有重要意义,同时也揭示了PR-1结构域的免疫调节功能,为新型免疫调节剂的发现提供了思路。