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目的：
随着人口逐渐老龄化,缺血性脑血管病的发病率逐年增高,目前已成为威胁人类生命的最主要疾病之一,其中脑梗死约占全部脑卒中的80％,脑梗死治疗的关键是减轻缺血半暗带神经元的凋亡,已有实验证实VEGF有减轻脑缺血区神经元凋亡的作用但其抗凋亡作用的机制还有待进一步研究。本实验研究人重组血管内皮细胞生长因子(rhVEGF165)通过调节P13K/Akt信号通路对氧糖剥夺(OGD,oxygen glucose deprivation)诱导SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)凋亡的影响,明确VEGF是否通过上调P13K/Akt信号转导通路中的p-Akt的表达,减少cleaved caspase-3的表达来抑制缺血缺氧神经细胞的凋亡,探讨VEGF对缺血缺氧神经细胞发挥保护作用的可能机制。
实验方法：
用含10％胎牛血清和HEPES液(终浓度10mmol/L)改良的高糖DMEM培养基培养SH-SY5Y细胞,每2-3天换液,取传代后3天的SH-SY5Y细胞,分为5组,A组(正常对照组);B组(OGD组):细胞缺血缺氧4小时,恢复氧和血清供给24小时;C组(VEGF干预组):细胞在氧糖剥夺(同B组条件)前30分钟加入rhVEGFl65(浓度为100ng/mL);D组(LY294002干预组):细胞在氧糖剥夺(同B组条件)前30分钟加入LY294002(浓度为50umol/L);E组(VEGF+LY294002双干预组):细胞在氧糖剥夺(同B组条件)前30分钟同时加入LY294002(浓度为50umol/L)及VEGF(浓度为100ng/mL)。采用ArmexinV-FITC/PI双染流式细胞分析仪检测细胞凋亡率,应用免疫荧光染色和Western-Blotting法检测p-Akt和cleaved caspasc-3的蛋白表达水平,观察rhVEGF165对氧糖剥夺的SH-SY5Y细胞的保护作用及对P13K/Akt信号转导通路中p-Akt、cleaved easpase-3表达的影响。
实验结果：
一、SH-SY5Y细胞凋亡结果。
氧糖剥夺后,B、C、D、E组细胞凋亡率均较A组(正常对照组)显著增高,差别有统计学意义(p＜0.05);C组(VEGF干预组)细胞凋亡率较B组(OGD组)显著减少,差别有统计学意义(p＜0.05);D组(LY294002干预组)细胞凋亡率较B组(OGD组)显著增高,差别有统计学意义(p＜0.05);E组(VEGF+LY294002双干预组)细胞凋亡率较C组(VEGF干预组)增高,差别有统计学意义(p＜0.05)。
二、免疫荧光结果。
实验各组均见p-Akt的表达,均以胞浆表达为主,偶见胞核表达,比较各组SH-SY5Y细胞荧光强度B组(OGD组)高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(p＜0.05);C组(VEGF干预组)荧光强度高于B组(OGD组)(p＜0.05);D组(LY294002干预组)荧光强度明显低于B组(OGD组)(p＜0.05);E组(VEGF+LY294002双干预组)荧光强度显著低于C组(VEGF干预组)(p＜0.05)。实验各组均见cleaved caLspase-3的表达,均以胞浆表达为主,比较各组SH-SY5Y细胞荧光强度B组(OGD组)显著高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(p＜0.05);C组(VEGF干预组)荧光强度明显低于B组(OGD组)(p＜0.05);D组(LY294002干预组)荧光强度明显高于B组(OGD组)(p＜0.05);E组(VEGF+LY294002双干预组)荧光强度显著高于C组(VEGF干预组)(p＜0.05)。
三、蛋白免疫印迹结果。
实验各组均见p-Akt的蛋白表达,B组(OGD组)p-Akt蛋白表达水平高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(p＜0.05);C组(VEGF干预组)p-Akt蛋白表达水平高于B组(OGD组),(p＜0.05);D组(LY294002干预组)p-Akt蛋白表达水平低于B组(OGD组),(p＜0.05);E组(VEGF+LY294002双干预组)p-Akt蛋白表达水平低于C组(VEGF干预组),(p＜0.05)。实验各组均见cleaved caspase-3的表达,B组(OGD组)cleaved caspase-3的蛋白表达水平明显高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(p＜0.05);C组(VEGF干预组)cleaved caLspase-3的蛋白表达水平明显低于B组(OGD组),差别有统计学意义(p＜0.05);D组(LY294002干预组)cleaved caspase-3的蛋白表达水平明显高于B组(OGD组),差别有统计学意义(p＜0.05);E组(VEGF+LY294002双干预组)cleaved caspase-3的蛋白表达水平明于高于C组(VEGF干预组),差别有统计学意义(p＜0.05)。
结论：
VEGF可减少氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞的凋亡,增加p-Akt的表达,减少cleaved caspase-3的表达,而LY294002(P13K特异性抑制剂)通过阻断P13K/Akt信号转导通路,抑制了VEGF的神经保护作用,提示VEGF可通过激活P13K/Akt信号转导通路,促使Akt的磷酸化,使p-Akt的表达增加,抑制Caspase-3的活化,使cleaved caspase-3的表达减少,从而减少氧糖剥夺后SH-SYSY细胞凋亡,对缺血缺氧后神经细胞起到保护作用。