多功能还原性氧化石墨烯纳米复合物的制备及其在乳腺癌检测和PTT/PDT中的应用

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目的:第一部分:制备低毒性、分散性好、稳定性高及电化学性能较高的还原性氧化石墨烯-二茂铁(RGO-Fc)复合物,并将其用于构建叶酸功能化的细胞传感器,探索具有操作简便、电化学性能较高、快速准确检测乳腺癌细胞MCF-7的细胞传感器。第二部分:制备分散性较好、生物安全性较高、光热转换能力良好及单线态氧产量较高的多功能还原性氧化石墨烯-二氧化锰-酞菁铜(RGO-MnO2-CuPc)复合物,并将其应用于光热疗法与光动力疗法联合(The combination of photothermal therapy and photodynamic therapy,PTT/PDT)杀伤乳腺癌MCF-7细胞的研究。方法:第一部分:首先通过π-π堆积相互作用制备RGO-Fc纳米复合物,采用紫外可见光谱(Ultraviolet-Visible,UV-Vis)、傅里叶红外光谱(Fourier Transform Infrared,FT-IR)、透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)分析对其进行多方面表征;其次,通过滴涂法和共价交联法将叶酸分子粘附MCF-7细胞固定在RGO-Fc修饰的玻碳电极表面;以乳腺癌细胞(MCF-7)为研究对象,采用电化学交流阻抗谱、方波伏安法研究MCF-7细胞在修饰电极的电化学行为。第二部分:采用自组装法制备RGO-MnO2-CuPc复合物,通过紫外可见光谱、傅里叶红外光谱、透射电镜分析、X-射线衍射分析(X-ray Diffraction,XRD)等方法对其进行多方面表征。通过光热转换实验考察其光热转换能力,采用UV-Vis光谱考察RGO-MnO2-CuPc在不同介质中MnO2的降解行为,采用磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)技术考察RGO-MnO2-CuPc复合物T1增强信号能力。以正常肝细胞(HL-7702)为研究对象,考察RGO-MnO2-CuPc复合物的细胞毒性。以人乳腺癌细胞(MCF-7)为研究对象,研究RGO-MnO2-CuPc复合物的体外PTT、PDT及PTT/PDT效应,采用改良的MTT法检测MCF-7细胞的存活率,比较PTT/PDT与单一PTT和PDT对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤效应。通过体外1O2猝灭实验考察1O2对PDT杀伤效应的影响;通过细胞划痕实验评估RGO-MnO2-CuPc复合物对MCF-7细胞的体外迁移能力的影响;利用流式细胞术考察RGO-MnO2-CuPc复合物的PTT/PDT对MCF-7细胞的凋亡诱导作用,初步探讨其杀伤癌MCF-7细胞的作用机理。结果:第一部分:RGO-Fc复合物的UV-Vis结果显示,RGO-Fc复合物在375 nm和498 nm处的吸收峰均发生了红移,且498 nm处吸收峰的强度明显降低,表明RGO与Fc通过π-π堆积作用成功复合;FT-IR结果显示,RGO-Fc复合物的羧基官能团中C=O伸缩振动从1463 cm-1红移至1457 cm-1,且RGO-Fc复合物分别在1089,1048,881 cm-1处仍有部分二茂铁的特征吸收峰,表明RGO和Fc借助π–π堆积作用结合,且RGO-Fc复合物制备成功;TEM结果表明Fc纳米粒子均匀分布在RGO片层上,且复合物仍为纳米片形貌;电化学交流阻抗谱、方波伏安法结果表明RGO-Fc具有优异的电子传输能力,其修饰的玻碳电极(RGO-Fc/GCE)电化学性能显著增强,FA组装在RGO-Fc/GCE表面后,RGO-Fc/GCE的电化学信号发生明显改变,表明通过EDC/NHS反应,将FA已固定在RGO-Fc/GCE表面,成功制备了叶酸功能化电极;实验条件的优化结果表明细胞和抗体的孵育时间对电极的敏感性影响显著,60 min为最佳孵育时间。采用方波伏安法测得峰值电流与MCF-7细胞浓度的对数呈良好的线性关系,其线性范围为1×102-1×105.8 cells·mL-1,检测限为53 cells·mL-1。第二部分:RGO-MnO2复合物的XRD结果显示,谱图中仅出现δ-MnO2的特征衍射峰,说明制备的MnO2晶型为δ型;UV-Vis结果显示,RGO-MnO2复合物在350-440 nm范围出现MnO2的特征吸收峰,且200-300 nm范围内GO的特征吸收峰消失,表明RGO-MnO2复合物成功制备;FT-IR结果显示,RGO-MnO2复合物在1754 cm-1附近的C=O振动吸收峰消失且其他吸收峰均发生减弱,在525 cm-1附近出现MnO2的Mn-O伸缩振动吸收峰,进一步证实RGO-MnO2复合物成功制备,当其表面负载CuPc后,RGO-MnO2的O-H键的振动吸收峰红移101 cm-1,且吸收峰拓宽,吸收强度增强,表明RGO-MnO2与CuPc成功复合。TEM结果表明制备的RGO-MnO2-CuPc纳米复合物呈片状结构;动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)实验结果表明RGO-MnO2-CuPc复合物的平均水合粒径为215.6 nm,且具有良好的分散稳定性;光热转换实验结果表明在808nm NIR光照射下,RGO-MnO2-CuPc复合物具有良好的光热转换能力,其光热效应存在时间依赖性;UV-Vis检测结果表明,在微酸性pH 6.50下,RGO-MnO2-CuPc复合物中的MnO2能与H2O2反应生成O2;MRI结果表明RGO-MnO2-CuPc复合物的T1加权成像随浓度的逐渐增大而逐渐变亮,其增强效应存在浓度依赖性,可以作为磁共振成像的T1型造影剂。体外细胞毒性实验结果表明:RGO-MnO2-CuPc复合物浓度在0200μg·mL-1范围内对HL-7702细胞无明显毒性,孵育48 h后细胞存活率均不低于75%,表明其具有良好的生物安全性;单纯光照射细胞后其存活率均高于90%,表明单纯光照对HL-7702细胞损伤作用很小;当RGO-MnO2-CuPc复合物浓度介于0200μg·mL-1时,其对MCF-7细胞暗毒性较低;RGO-MnO2-CuPc复合物的IC50值显著低于单一的纳米材料,为25.96μg·mL-1,RGO-MnO2复合物具有双重光热杀伤效应,且RGO-MnO2-CuPc复合物在PTT/PDT中对MCF-7细胞的杀伤效应均强于单一的PTT和PDT;体外单线态氧猝灭实验结果表明RGO-MnO2-CuPc在PDT过程中可以产生1O2且杀伤MCF-7细胞;流式细胞术检测结果表明RGO-MnO2-CuPc复合物的PTT/PDT对MCF-7细胞的杀伤效应主要通过诱导细胞凋亡实现;细胞划痕实验结果表明RGO-MnO2-CuPc复合物在PTT/PDT过程中可抑制MCF-7细胞的体外迁移能力。结论:第一部分:本实验制备的RGO-Fc复合物低毒、分散性好、稳定性高以及电化学性能较高,且成功构建叶酸功能化的细胞传感器,其可以选择性检测乳腺癌MCF-7细胞,具有良好的稳定性。叶酸功能化细胞传感器在乳腺癌早期诊断方面具有很大的应用潜力。第二部分:采用水热法和自组装法成功制备RGO-MnO2复合物和RGO-MnO2-CuPc复合物,此法操作简单、成本低。制备的RGO-MnO2-CuPc复合物具有优异的光热转换能力、可有效产生单线态氧,且可作为优良的磁共振成像的T1型造影剂。与单一的PTT或PDT相比,RGO-MnO2-CuPc复合物用于PTT/PDT对MCF-7细胞的杀伤效应更显著,其主要通过诱导细胞凋亡杀伤MCF-7细胞,且可抑制MCF-7细胞体外迁移能力。RGO-MnO2-CuPc复合物在乳腺癌联合治疗方面显现潜在的应用前景。
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