炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的主要致病因子,它包含三种蛋白组分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与两种细胞受体(TEM8和CMG2)的结合是炭疽毒素进入靶细胞的关键步骤。基于炭疽毒素进入正常细胞的基本机理,可溶性CMG2 vWA结构域(以下简称sCMG2)和可溶性TEM8vWA结构域(以下简称sTEM8)作为炭疽毒素受体类抑制剂已有研究,实验结果表明sCMG2较有潜力。根据本实验室前期研究得到TEM8-PA复合物晶体结构模型,推测出sTEM8突变体L56A有抗炭疽活性,是潜在的受体类抑制剂。TEM8在肿瘤细胞特异性高表达,是潜在的抗肿瘤药物设计靶点。已有报道通过修饰PA,使炭疽毒素成为肿瘤细胞靶向性毒素。本文研究目的是在前期研究基础上,以PA与受体相互作用晶体结构为设计靶点,以增强PA与TEM8结合能力为目标,推测影响PA与两个受体相互作用差异的TEM8和PA结构域II关键残基,设计炭疽受体类抑制剂TEM8突变体和肿瘤毒素PA突变体,并在体内外进行筛选评价。第一部分基于炭疽毒素与受体相互作用的抗炭疽TEM8突变体药学评价本文基于炭疽毒素与两种受体相互作用复合物晶体结构差异,分析推测出TEM8的L56残基突变后,由于静电作用可以使TEM8与PA更加紧密地结合。因此,我们设计sTEM8突变体L56A,为潜在的受体类抑制剂。大肠杆菌表达得到了sCMG2、sTEM8及TEM8突变体L56A。sCMG2、sTEM8和L56A在J774A.1细胞对炭疽致死毒素(LeTx, PA+LF)的抑制作用IC50有显著差异:sTEM8为274.6±8.7 nM;L56A为69.5±5.8 nM;sCMG2为20.8±1.5 nM。sCMG2对LeTx的抑制能力在三者中最强。sCMG2、sTEM8、L56A在F344大鼠体内对LeTx的抑制作用结果为sTEM8:PA摩尔比5:1时,能够完全保护大鼠;3:1和1:1组不能完全保护。sCMG2和L56A都在其与PA摩尔比为3:1和1:1时,完全保护大鼠。L56A:PA摩尔比为0.6:1时,大鼠存活时间为115.3±9.7 min,sCMG2:PA摩尔比为0.6:1时,大鼠存活时间为91.7±4.1 min,两者有统计学差异(P=0.0350),表明L56A在大鼠体内抗炭疽能力略强于目前较有效的受体类抑制剂sCMG2。为了探究受体类抑制剂在体内与体外活性差异的真正原因,揭示炭疽毒素受体类抑制剂在体内的行为机制,引入药物代谢的方法研究三种受体类抑制剂在体内的吸收、代谢、分布、排泄的过程。建立及确证了同位素标记法sCMG2、sTEM8和L56A大鼠体内代谢评价方法。标记得到125I-L56A浓度为248.51μg·ml-1,放射比活度为141.23 kBq·μg-1; 125I-sTEM8浓度为135.91μg·ml-1,放射比活度为198.19 kBq·μg-1; 125I-sCMG2浓度为370.89μg·ml-1,放射比活度为56.67 kBq·μg-1。在体液和组织中,125I-L56A、125I-sTEM8、125I-sCMG2原形主要在TCA沉淀部分,因此,以TCA沉淀放射性考察其代谢动力学。对方法的灵敏度、线性和精密度、回收率进行考察,均符合代谢动力学研究要求。对125I-L56A、125I-sTEM8和125I-sCMG2代谢动力学进行研究。三个标记蛋白静脉给予13.5μg/只,5min、30min、4h血和尿进行分子筛排阻放射性色谱分析。结果表明,三种标记蛋白均代谢较快。125I-L56A、125I-sTEM8与血清蛋白结合,使其在体内作用时间延长,即消除半衰期延长。而125I-sCMG2不与血清蛋白结合,以原形存在于血清中。这可能是导致L56A与sCMG2在J774A.1细胞和大鼠体内抗炭疽能力差异的原因。这一点由药代动力学参数得到了证明。采用非房室模型计算药代动力学参数:sCMG2, sTEM8和L56A消除半衰期分别为0.4±0.1h,0.8±0.1h和0.8±0.0h。考察了125I-L56A、125I-sTEM8和125I-sCMG2静脉给予13.5μg/只后,5min、30min和4h组织分布情况。结果表明125I-L56A和125I-sTEM8靶器官是肺,125I-sCMG2靶器官是肾。目前研究已经表明肺是炭疽感染和致病的主要器官。因此,L56A与CMG2组织靶向性的差异,也可能是导致L56A与sCMG2在J774A.1细胞和大鼠体内抗炭疽能力差异的原因。第二部分基于炭疽毒素与受体相互作用的抗肿瘤TEM8靶向性PA突变体设计本文基于炭疽毒素与受体相互作用差异设计TEM8靶向性PA作为肿瘤靶向性毒素。通过比较PA-TEM8结构模型与PA-CMG2晶体结构,推测出PA II区340LAGE343 loop与两受体的相互作用存在关键差异。优先与TEM8结合的PA结构域II关键性的氨基酸位点为L340、A341。根据电荷互补作用将L340突变为带正电的L340R;A341突变为带负电的A341E和A341D;再进行双突变得到L340R+A341D和L340R+A341E。联合已报道的,应用噬菌体展示技术得到的能够与TEM8选择性结合的PA结构域IV突变体R659D/M662R (D7),设计出L340R+R659D,L340R+D7(BD7)。制备得到了上述蛋白。以高表达CMG2的鼠巨噬细胞J774A.1为模型检测PA突变体对正常细胞毒性,进行安全性研究。以高表达TEM8的人宫颈癌Hela细胞为模型筛选PA突变体的抗肿瘤活性,进行有效性研究。实验证明BD7是突变体中安全性高、有效性强的候选药物。优于目前文献报道的TEM8特异性结合抗肿瘤炭疽毒素PA结构域IV突变体D7。在主要脏器肿瘤细胞(人大细胞肺癌NCI-H460细胞,人前列腺癌DU-145细胞,人肝癌SMMC-7721细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞)对BD7进行评价,寻找BD7敏感肿瘤细胞系。结果显示,在这几种细胞中NCI-H460对BD7+FP最敏感。提示BD7在体内可能会对NCI-H460细胞有靶向性。BD7的抗肿瘤能力提示PA结构域II和PA结构域IV在与受体结合时可能起到协同作用。BD7可能发展成肿瘤细胞/正常组织细胞诊断蛋白。在NCI-H460荷瘤裸鼠体内评价肿瘤靶向性炭疽毒素BD7的抗肿瘤能力。实验分为PBS空白对照组;PA+FP对照组;D7+FP低中高剂量组;BD7+FP低中高剂量组。动物身体状态和病理分析表明,BD7比文献已报道的具有抗肿瘤活性TEM8靶向性PA突变体D7安全性更强。BD7在0.04 mg/kg~0.2mg/kg之间可能有抗肿瘤药效。在此基础上进行BD7最大耐受剂量实验,动物身体状态和病理分析结果显示BD7+FP 0.15mg+ 0.02mg/kg是裸鼠最大耐受剂量。重新设计BD7+ FP剂量,对NCI-H460荷瘤鼠抑瘤实验正在进行。综上所述,以炭疽毒素与受体相互作用晶体结构为靶点,设计炭疽受体类抑制剂和肿瘤毒素。通过筛选评价出炭疽受体类抑制剂TEM8突变体L56A。发现了L56A体内作用规律:L56A与血清蛋白结合延长其消除半衰期;其靶向于炭疽感染的主要器官肺。同时,本文设计筛选的肿瘤靶向毒素PA突变体BD7表现出良好的抗肿瘤趋势。得到的炭疽受体类抑制剂L56A和肿瘤靶向性毒素BD7具有良好的应用前景。本文证实了基于炭疽毒素与受体相互作用晶体结构设计炭疽受体类抑制剂和肿瘤毒素的可行性,炭疽毒素与受体相互作用晶体结构可作为今后炭疽受体类抑制剂和肿瘤毒素的设计靶标。