论文部分内容阅读
禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的具有传染性的肿瘤性疾病。该病以水平和垂直两种方式传播,目前暂无可用疫苗以及有效的治疗药物,在世界各国养禽业广泛流行,危害严重。种群净化、降低感染率是防制病毒传播的主要方式。禽白血病被列入2012～2020年国家中长期动物疫病防治规划中的优先防治病种之一。因而,建立快速、有效的禽白血病检测方法对于临床诊断、监测、净化是十分必要的。p27蛋白是禽白血病基因组中基因编码的群特异性抗原,是ALV核心衣壳蛋白的主要成分,有很多病毒抗原位点,常常作为检测抗体的首选。本研究利用酵母表达系统对ALVp27基因进行表达,并且以该蛋白为包被抗原建立了禽白血病间接ELISA检测方法,为p27蛋白的大规模生产以及禽白血病检测试剂盒的进一步研制提供理论基础。禽白血病p27基因在毕赤酵母中的表达根据Gene Bank中已发表的禽白血病基因全序列中p27基因的序列,用PrimerPremeir5.0软件设计含EcoR I和Not I酶切位点的一对特异性引物,以ALVRNA为模板,RT-PCR扩增目的基因;将p27基因连接到pMD18-T载体,得到克隆质粒pMD18-T-p27;利用DNA重组技术,将酵母表达质粒pPIC9K和克隆质粒pMD-p27酶切后,再连接,得到酵母表达质粒pPIC9K-p27。将鉴定正确的的阳性酵母表达质粒pPIC9K-p27通过电击转染到毕赤酵母细胞GS115中,进行诱导表达;优化后诱导条件为:当时间为24h,甲醇浓度1%,pH7.0,28℃时,p27蛋白的表达量最高(26.2μg/mL)。基于p27蛋白的禽白血病间接ELISA方法的建立经过方阵滴定试验对反应条件的筛选,确定将p27作为包被抗原的间接ELISA方法的最适条件为:包被浓度2.5μg/mL;5%脱脂奶粉封闭1.5h;血清稀释度为1:200;待检血清作用1.5h;HRP标记的兔抗鸡IgY稀释度为1:5 000;37℃1h;显色液12min;确定临界值为0.1979。利用优化后的的ELISA检测方法同时对IBDV、MDV、NDV、IBV、REV、禽白血病病毒阳性血清与阴性血清进行检测,具有较好的特异性。同商品化的ELISA试剂盒进行比较,在检测的80份疑似AL的鸡血清,符合率为96.92%,同时阳性检出率更高,符合性好;通过优化后的ELISA检测方法进行批内、批间的变异系数都小于8%,具有较高的重复性;利用优化后的的ELISA检测方法对314份疑似ALV的鸡血清进行检测,阳性数量236份,阳性率为75.15%。