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目的:癫痫是一组异质性慢性神经系统疾病,具有癫痫发作类型多样的特点,由于大脑中异常的兴奋性或同步性神经元活动,带来许多社会歧视[1]。世界卫生组织（WHO）2001年发布的数据显示,神经系统疾病约占所有生活残疾总年数的30.8%,而癫痫,约占疾病总负担的0.5%[2],全球患病率为每1000人1.5至14人[3]。癫痫在所有年龄段都有发生,但最常见的是儿童[4],理想的合理治疗对减少癫痫引起的脑损伤及减轻全球疾病负担具有重要意义。癫痫患者中,大约有30%的患者属于难治性癫痫,即药物难以控制的癫痫。癫痫手术是目前对于部分抗药性的局灶性癫痫病人获得长期癫痫发作缓解最有效的治疗方法。但基于手术风险高,后果难以逆转等原因,并不能广泛应用。目前基于大量的基因研究,分子靶向药物治疗癫痫已经引起学术界大量的关注。因此,深入探讨癫痫潜在的分子病理机制对于开发新的更有效的治疗靶点具有重要意义。Mi RNA可以通过破坏靶m RNA的稳定性、抑制靶m RNA的翻译来对靶m RNA发挥调控作用。目前,大量研究发现micro RNAs的异常表达与神经系统损害和包括癫痫在内的退行性疾病密切相关。据报道[5,6],癫痫发作后30分钟内,患者血清中有200多种miRNAs表现出不同的表达[7]。研究报道大量miRNAs在颞叶癫痫病人和癫痫动物海马组织中呈现出异常的表达水平[8,9],且miRNAs在颞叶癫痫病理进程中发挥多种调控作用。mmu-miR-330-5p（miR-330-5p）被报道[10]在匹罗卡品诱导的小鼠癫痫模型中呈表达下降,这暗示miR-330-5p可能参与到癫痫的病理机制中。因此,深入研究miR-330-5p在癫痫中的作用具有一定的理论基础并且有助于研发新的治疗靶点。近年来对难治性癫痫患者脑组织的分析表明,炎症过程和凋亡在癫痫的发病机制中起重要作用。Toll-Like Receptors（TLRs）激活在上述过程中发挥重要作用。大量研究表明TLR4在癫痫病人和动物中表达升高并参与到癫痫的发病机制中。值得注意的是,通过生物信息学分析,我们发现miR-330-5p可靶向结合TLR4的3’非编码区。因此,我们推测通过调节miR-330-5p的表达进而靶向调节TLR4的表达,从而对癫痫的发展起调控作用。生酮饮食对癫痫的治疗作用已经被大量文献所报道和证实。此外,有报道显示生酮饮食可以调控miRNA的表达。且研究发现生酮饮食能够抑制大鼠背根神经节的神经炎症和TLR4/NF-κB信号通路。鉴于此,本研究通过建立小鼠癫痫模型及细胞实验,验证miR-330-5p与TLR4的靶向关系,以及过表达miR-330-5p对TLR4表达的影响,进一步探讨过表达miR-330-5p对于癫痫小鼠海马组织神经细胞凋亡和神经炎症的影响及其相关分子机制。此外,本研究也同时探究了生酮饮食对于miR-330-5p及TLR4表达的影响,即探究生酮饮食是否通过改变miR-330-5p及TLR4的表达起到治疗作用。研究方法:1、本研究通过腹腔注射匹罗卡品诱导C57BL/6雄性小鼠癫痫发作,采用Racine’s标准评分系统对癫痫小鼠的癫痫活动进行评分,并于匹罗卡品注射1小时后对小鼠进行脑电图检测,并定量分析振幅和峰值频率。2、Target Scan网站预测miR-330-5p与TLR4的靶向结合位点,并采用双荧光素酶实验在293T细胞中验证二者的靶向结合。3、细胞实验验证miR-330-5p与TLR4的靶向关系:HEK293T细胞分别转染mimics NC,miR-330-5p mimics,inhibitor NC,miR-330-5p inhibitor,48小时后q PCR检测mimics NC,miR-330-5p mimics两组的miR-330-5p的水平,验证转染是否成功。Western blot检测以上各组细胞中TLR4的蛋白水平。4、动物实验造模及分组:control,癫痫,癫痫+miR-330-5p mimics NC,癫痫+miR-330-5p mimics。mimics NC和miR-330-5p mimics组小鼠通过侧脑室注射mimics NC或miR-330-5p mimics。注射24小时后,采用腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫发作。采用过量注射pentobarbital处死小鼠。5、通过HE染色检测各组小鼠海马组织（CA1区）形态变化;6、验证各组小鼠miR-330-5p及TLR4的表达水平及靶向关系:通过q PCR检测各组海马组织中miR-330-5p和TLR4的表达水平;通过western blot检测各组TLR4水平;通过免疫组化法检测各组海马组织中TLR4表达。7、验证过表达miR-330-5p对癫痫小鼠炎症反应的影响:ELISA试剂盒检测各组小鼠血液中IL-1β,IL-6和IL-18的水平;8、验证过表达miR-330-5p对癫痫小鼠神经细胞凋亡的影响:Nissl’s染色检测各组海马组织中（CA1区）细胞凋亡并定量分析凋亡细胞百分比;Western blot检测各组海马组织中cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax和p53蛋白水平;9、验证过表达miR-330-5p对癫痫小鼠NF-κB通路激活的影响:Western blot检测各组海马组织中IκBα（NF-κB抑制蛋白a）,p-IκBα（磷酸化IκBα）,NF-κB p65的表达水平;10、生酮饮食喂养及造模:C57BL/6小鼠随机分为control+control diet（CD）,癫痫+CD,control+ketogenic diet（KD）,癫痫+KD四组。癫痫组小鼠按照上面的方法诱导癫痫。pilocarpine注射后前6周,所有小鼠均采用CD喂养,从第7周开始,按照分组采用CD或KD进行喂养。pilocarpine注射21周后所有小鼠注射过量的pentobarbital处死。随后取各组小鼠海马组织待测;11、验证生酮饮食对癫痫小鼠miR-330-5p/TLR4轴的影响:Real-time PCR检测各组海马组织中miR-330-5p和TLR4的表达水平;Western blot检测各组海马组织中TLR4的蛋白水平。结果:1、Racine评分及脑电图结果表明,癫痫小鼠造模成功。另外,过表达miR-330-5p可减轻小鼠的癫痫发作,表现为发作频率和发作程度的降低。2、双荧光素酶实验验证了miR-330-5p与TLR4的靶向关系,二者之间存在特异性结合位点。同时293T细胞转染后各组细胞的q PCR及western blot实验,miR-330-5p mimics组较对照组TLR4水平降低,而miR-330-5p inhibitor组TLR4水平升高,验证了miR-330-5P与TLR4的靶向关系,即过表达miR-330-5p可降低TLR4的表达。3、q PCR及Western Blot实验检测癫痫组小鼠与对照组小鼠海马组织中TLR4及miR-330-5p的结果,发现癫痫组小鼠TLR4水平均较对照组升高,而癫痫组小鼠miR-330-5p水平较对照组下降。这验证了miR-330-5p及TLR4与癫痫的关系。4、HE染色和尼氏体染色,观察各组小鼠海马组织CA1区神经细胞的形态,结果发现对照组小鼠海马CA1区神经元排列清晰,形态正常,未见神经元损伤,而癫痫组小鼠海马CA1区神经元明显丢失。与模型组相比,注射miRNA-330-5p模拟物的小鼠海马CA1区神经元损伤明显减轻。而注射miR-330-5p NC对海马CA1区神经元损伤无明显影响。5、q PCR及Western Blot及免疫组化实验结果发现,癫痫组小鼠较对照组小鼠TLR4水平升高,同时,癫痫+miR-330-5p mimics组小鼠较癫痫+mimics NC组小鼠TLR4水平降低。说明过表达miR-330-5p可以降低TLR4的表达。6、ELISA实验发现癫痫组小鼠较对照组小鼠IL-1β,IL-6和IL-18的表达水平均升高,同时,癫痫+miR-330-5p mimics组小鼠较癫痫+mimics NC组小鼠IL-1β,IL-6和IL-18的表达水平均降低,提示过表达miR-330-5p可能通过降低IL-1β,IL-6和IL-18的表达水平减轻癫痫后炎症反应。7、Western blot实验发现癫痫组小鼠海马组织cleaved caspase-3,Bax和p53蛋白水平较对照组升高,而BCL-2水平较对照组降低。同时,癫痫+miR-330-5p mimics组小鼠较mimics NC组cleaved caspase-3,Bax和p53蛋白水平降低,而BCL2水平较NC组升高。这些凋亡相关蛋白的变化意味着过表达miR-330-5p可以减轻癫痫小鼠海马区的细胞凋亡。8、Western blot实验发现癫痫组小鼠较对照组小鼠检测各组海马组织中p-IκBα（磷酸化IκBα）,NF-κB p65的表达水平升高,而IκBα（NF-κB抑制蛋白a）的表达水平较对照组降低;同时,癫痫+miR-330-5p mimics组小鼠较mimics NC组p-IκBα（磷酸化IκBα）,NF-κB p65的表达降低,而IκBα（NF-κB抑制蛋白a）的表达水平较癫痫+mimics NC组升高。这意味着过表达miR-330-5p对癫痫小鼠炎症相关的NF-κB通路有抑制作用。9、最后,我们通过western blot及q PCR实验发现model+CD组小鼠较control+CD组小鼠TLR4水平显著升高,miR-330-5p水平较对照组下降,model+KD组小鼠较model+CD组小鼠TLR4水平明显降低,然而,我们通过q PCR实验发现model+KD组小鼠较model+CD组小鼠miR-330-5p水平略升高,但差距没有统计学意义。这表明生酮饮食能够降低癫痫小鼠TLR4的表达水平,但并未能证明生酮饮食对miR-330-5p的表达有显著影响。结论:1、miR-330-5p与TLR4存在特异性结合位点,过表达miR-330-5p可降低TLR4的表达。2、过表达miR-330-5p能够下调癫痫小鼠海马组织中TLR4的表达,降低炎性细胞因子IL-1β,IL-6和IL-18的水平,过表达miR-330-5p可抑制NF-κB信号通路的激活,从而减轻癫痫小鼠的神经炎症反应。3、过表达miR-330-5p可以减轻癫痫小鼠海马的神经细胞凋亡并减轻神经元损伤。4、本研究发现生酮饮食能够降低癫痫小鼠海马区TLR4的水平,但生酮饮食对于癫痫小鼠海马的miR-330-5p的表达无显著影响。