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目的:1.为了寻求最佳的分离条件,设计不同胰蛋白酶浓度、不同消化时间分离大鼠表皮细胞。2.在进行大鼠表皮细胞的最佳分离条件的基础上,探讨皮肤面积与表皮细胞数量的关联性。并测定表皮细胞的面积。3.制作大鼠Ⅲ度烧伤模型,在前面工作的基础上,设定不同的移植密度治疗大鼠烧伤创面,并观察创面愈合情况。探讨原代自体表皮细胞移植治疗烧伤的可行性,适宜的移植密度。方法:1.最佳分离条件的测定采用3个不同消化酶浓度和3个不同的消化时间,设为9组。免疫细胞染色鉴定,台盼蓝进行活细胞计数。通过MTT法间接测定活力细胞的数量,通过正交分析判定最佳的消化酶浓度和消化时间,即最佳分离条件。2.在最佳分离条件下分别消化不同面积的大鼠皮肤,分为5组,统计学分析皮肤面积与表皮细胞数量之间的关联性。在24孔板里培养一定数量的表皮细胞,用显微测微尺测定细胞面积。3.建立大鼠烧伤模型,分为治疗组(A、B、C)和对照组(D)。治疗组采用不同细胞移植密度治疗,A组:6.0×10~4/cm~2;B组:1.2×10~5/cm~2;C组:2.4×10~5c/m~2。术后观察各组大鼠的创面的愈合情况,观察并记录各组大鼠创面瘢痕愈合数量和收缩比例等。结果:1、消化得到的细胞经免疫染色证实了分离出的细胞为表皮细胞。未贴壁时细胞呈圆球型,贴壁后呈多角形,培养后呈铺路石样特征,为表皮细胞典型特征。各组台盼蓝染色活细胞计数;MTT法测定活力细胞数量,两个计数结果均经统计学正交分析分析证实:最佳的消化酶浓度和时间是0.25%胰蛋白酶,16小时,即最佳分离条件。2、不同面积大鼠皮肤经最佳分离条件消化后分离得到的表皮细胞,经统计学分析显示,皮肤面积与表皮细胞成线性相关,并得到线性方程。表皮细胞接种到24孔板后,用显微测微尺测量细胞参数,得到表皮细胞面积6540±450um~2。3、移植后A组死亡一只,B组和C组均因感染导致移植失败各一只。A组瘢痕愈合数9例;B组瘢痕愈合数1例;C组瘢痕愈合0例;D组均为瘢痕愈合15例。在创面收缩比例上D组达84.5%,A、B、C组分别为34.3%、20.1%、18.9%。经统计学分析瘢痕愈合:BC组间差异无统计学意义,其余各组间差异均有意义;收缩比例:BC组间差异无统计学意义,其余各组间差异均有意义。结论:1.胰蛋白酶-EDTA消化法可以成功分离表皮细胞,经鉴定为表皮细胞,并经培养证实形态和功能良好。正交分析结果提示:在冷消化法中最佳的消化酶浓度和消化时间是0.25%胰蛋白酶0.04%EDTA(1:1),16小时。冷消化法真皮刮除法最佳的分离条件是以上的消化酶浓度和时间。2.实验证实皮肤面积和表皮细胞数存在关联性,两者呈正相关。通过统计学分析得到线性回归方程y(细胞数×10~5)=6.445x+0.17。3.大鼠烧伤模型的制作是成功的;原代自体表皮细胞移植治疗烧伤是可行的;治疗的可行移植密度是1.2×10~5/cm~2;皮肤面积和治疗面积的对应关系:1cm~2皮肤可以治疗5.5cm~2的切痂区域。