糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，对酶的结构和功能有着重要影响。课题组前期筛选到一株能定向转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的真菌Penicillium purpurogenum Li-3，并对其催化反应的β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因进行了克隆和Pichia pastoris GS115的重组表达系统的构建，但其催化特性和对甘草酸糖苷键的识别发生了改变，通过蛋白质糖基化染色初步判断可能是蛋白质翻译后修饰的不同引起的。针对β-D-葡萄糖醛酸苷酶P.pastoris GS115重组表达系统催化与底物识别存在的差异，本文以P.purpurogenum Li-3β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因为研究对象，开展了基因的糖基化位点分析及其定点突变，构建了各突变体的P.pastoris GS115表达系统，探索了糖基化对β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性的影响。研究结果如下：　　 对P.purpurogenum Li-3β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因pgus进行分析，发现28、231、383和594位为潜在的N-糖基化位点，并运用重叠延伸PCR和大引物PCR的突变方法将pgus基因28、231、383和594位的天冬酰胺(AAC)突变为谷氨酰胺(CAA)，获得了四个突变体基因pgus-N28Q、pgus-N231Q、pgus-N383Q和pgus-N594Q。　　 构建了N-糖基化位点突变基因的重组表达载体pPIC9K-N28Q、pPIC9K-N231Q和pPIC9K-N3830，并分别电击转化P.pastoris GS115进行表达，对比研究了β-D-葡萄糖醛酸苷酶28、231和383位N-糖基化位点突变前后酶学性质。结果表明：重组β-D-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)最适反应温度为45℃，而突变体PGUS-N28Q、PGUS-N231Q和PGUS-N383Q的最适反应温度分别为60℃、65℃和50℃；各突变体酶分别在65℃保温处理，与PGUS-P相比，酶活下降均较慢，突变酶的最适反应温度均有上升趋势，且温度稳定性增加，说明N-糖基化对酶的热稳定性有重要影响。PGUS-P最适反应pH为4.6，且具有较高的pH耐受性；突变酶PGUS-N28Q、PGUS-N231Q、PGUS-N383Q的最适pH分别为7.8、7.8、4.6和6.6，但其pH耐受性较差。28、231和383位的天冬酰胺突变后酶的最适反应pH值发生了迁移，说明糖链对酶蛋白的解离状态有重要影响。对比突变前后酶的催化能力，发现28、231和383位点突变后酶的比活力相对下降了36.4％、40％和58.8％，表明N-糖基化影响了酶与底物的结合。　　 采用硫酸铵沉淀、凝胶层析、DEAE离子交换层析等方法对PGUS-P及其突变酶PGUS-N28Q、PGUS.N231 Q和PGUS-N383Q进行了分离纯化研究。表明：硫酸铵沉淀最佳浓度为70％，离子交换最佳洗脱液为0.2M NaCl的pH7.0磷酸钠缓冲液；纯化倍数为12，回收率为35.2％。经SDS-PAGE检测及蛋白迁移率的变化，结合酶催化特性结果表明28位、231位和383位发生了N-糖基化修饰。通过三维空间分子模拟，发现重组P.pastoris GS115表达的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的28、231和383三个N-糖基化位点均位于酶蛋白的外侧，此种结构理论上有利于翻译后糖基化修饰。