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研究背景及目的心房颤动(房颤,AF)是一种临床上最常见的心律失常之一,具有高发病率、高致残率和疗效不佳等特点,严重影响了患者的健康状况与生活质量。目前房颤的治疗主要包括药物治疗、外科手术及导管射频消融等,但房颤的治疗效果不佳,消融后复发率高。这主要与房颤的发病机制尚未完全明确有关。研究发现,心房重构是房颤的重要发病机制,主要包括结构重构、电重构和神经重构。其中,心脏神经重构是房颤触发和维持的重要因素。心脏自主神经系统分为心脏内在自主神经系统和外在自主神经系统。其中心脏内在自主神经重构可促使房颤发作,房颤发作后使神经重构更为显著,二者互相影响,促进房颤的维持,然而目前房颤自主神经重构的发生机制并不十分明了。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小RNA,可以在转录后水平对基因表达进行调控。近年来,关于miRNA在房颤的神经重构中的作用有了新的认识。已有研究表明,miR-206通过调节超氧化物歧化酶的表达促进房颤心脏自主神经重构,证明miR-206在房颤神经重构中发挥着重要作用。但miR-206通过调节其他通路对房颤自主神经重构的影响目前尚未具体阐明。磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因编码的Ⅰ型三磷酸鸟苷环化水解酶(guanosine triphosphate cyclohydrolase I,GTPCH I)是四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)从头合成的限速酶,而BH4是一氧化氮(NO)合成的必需辅因子。先前研究证实,在动物房颤模型中,心肌BH4含量显著下降,促进房颤结构重构与电重构,而给予外源性BH4补充可以显著降低房颤诱发率,证明了 BH4参与房颤的重构过程。但目前尚没有文献报道BH4通路与房颤自主神经重构的关系。本研究通过建立犬的房颤模型,观察GCH1在房颤犬心房组织中的表达变化,及miR-206对GCH1/BH4通路的影响。并且在犬心房组织中感染GCH1过表达慢病毒,观察GCH1表达上调对神经生长的作用。探讨miR-206能否通过调控GCH1/BH4通路影响房颤自主神经重构,为房颤的神经重构机制研究提供更多新的思考。材料与方法1.犬房颤模型建立健康成年杂种犬24只,雌雄不拘,体质量10～20kg,随机分为起搏组(n=6),起搏+miR-206过表达组(n=6),起搏+miR-206沉默组(n=6)和对照组(n=6)。前三组以400次/min持续右心房起搏4周。对照组操作同起搏组,但不打开起搏器开关。4周后在前三组犬右上脂肪垫(RSFP)中分别注射相应慢病毒,处死对照组动物,取RSFP周围小于0.5cm的心房组织。2.心肌细胞分离与培养取健康杂种幼犬心房组织,剪成1mm3左右的组织块,用胶原酶和胰蛋白酶溶液充分消化后,将细胞悬液接种到培养皿中,放置在培养箱中培养。应用差速贴壁法分离心肌细胞与心肌成纤维细胞。3.慢病毒的构建构建miR-206过表达、miR-206沉默、miRNA阴性对照、GCH1过表达、GCH1沉默及GCH1的阴性对照慢病毒,病毒滴度为1×109TU/ml。4.实验分组及慢病毒感染4.1慢病毒的在体感染健康成年杂种犬24只,随机分为miR-206过表达组、miR-206沉默组、GCH1过表达组和GCH1沉默组,每组6只。在RSFP中注射相应慢病毒,2周后处死。上述三组起搏犬RSFP中注射相应慢病毒,其中起搏组犬注射阴性对照慢病毒,2周后处死。4.2慢病毒的体外感染用miR-206过表达、miR-206沉默、GCH1过表达和GCH1沉默慢病毒分别感染各组心肌细胞48h,阴性对照慢病毒感染对照组细胞。5.电生理指标检测心房有效不应期(AERP)通过多通道程序刺激仪分别于转染前、转染2周后对miR-206过表达组、miR-206沉默组、GCH1过表达和GCH1沉默组进行电生理检查,基础起搏刺激周长为150ms,S1S2呈8:1,步长5ms,AERP定义为S2不引起心房激动的最长S1S2间期。6.实时定量RT-PCR实时定量RT-PCR检测起搏及慢病毒转染后心肌组织和心肌细胞中GCH1和蛋白基因产物9.5(PGP9.5)mRNA的表达水平。7.免疫组化分析对GCH1过表达组、对照组及GCH1沉默组心肌组织中PGP9.5行免疫组化染色,计算神经密度。8.Western blot 检测Western blot检测起搏及慢病毒转染后心肌组织和心肌细胞中GCH1和PGP9.5的蛋白表达水平。9.荧光素酶分析报告通过荧光素酶分析报告验证GCH1是miR-206的靶基因。10.RSFP中NO含量检测通过硝酸还原酶法测定NO含量。波长550nm,光径0.5cm,双蒸水调零,测定各管OD值。11.RSFP中BH4含量检测按照ELISA试剂盒说明书进行操作检测,在450 n m波长下测量各孔的吸光度值,绘制标准曲线。结果1.在起搏组及miR-206过表达组中,PGP9.5 mRNA及蛋白表达较对照组均明显上调,在起搏+miR-206过表达组中PGP9.5表达上调最明显。但在miR-206沉默组中,PGP9.5含量明显下降。2.miR-206过表达组AERP明显缩短,而miR-206沉默组AERP延长。GCH1过表达组AERP明显延长,而GCH1沉默组AERP缩短。3.荧光素酶报告验证了 GCH1是miR-206的靶基因。miR-206过表达组中GCH1mRNA及蛋白表达均下降,而miR-206沉默组中GCH1mRNA及蛋白含量增加。4.miR-206过表达组RSFP中BH4和NO含量下调,而miR-206沉默组中BH4和NO水平明显升高。GCH1过表达组中BH4和NO含量明显增加,而GCH1沉默使BH4和NO含量减少。5.GCH1过表达组中PGP9.5 mRNA及蛋白表达均明显下调,神经密度下降。而GCH1沉默组中PGP.5表达上调,神经密度增加。结论MiR-206通过调控靶基因GCH1发挥促进房颤心脏自主神经重构的作用。GCH1过表达通过增加BH4含量抑制房颤心脏自主神经重再生及房颤的发生。