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目的：建立耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）的人结肠癌DLD-1细胞系的肿瘤耐药株（DLD-1/5-Fu）,研究亲本和耐药株在形态学、倍增时间、5-Fu耐药性、细胞周期分布等生物学特性上的差异。检测亲本和耐药株在肿瘤干细胞占有比例、多药耐药蛋白P-gp及DNA修复蛋白MGMT表达水平上的差异以探索三者是否与结肠癌的5-Fu耐药有关。方法：采用持续接触浓度递增诱导法建立人结肠癌耐药株DLD-1/5-Fu；使用高倍显微镜观察细胞的形态改变情况并摄片；CCK-8法绘制亲本和耐药株的生长曲线，并计算细胞倍增时间；CCK-8法检测DLD-1和DLD-1/5-Fu的半数抑制浓度（IC50），并计算耐药指数（RI）；流式细胞术分析细胞周期分布情况；流式细胞术检测两种细胞中CD133+，即结肠癌干细胞的比例；Western Blot检测多药耐药蛋白P-gp和DNA修复蛋白MGMT的蛋白表达量；RT-PCR检测MGMT的mRNA表达量。结果：使用初始浓度为0.2μM的5-Fu作用于DLD-1细胞系，待其重新生长铺满培养瓶底90%时增加药物浓度，依次至浓度为200μM为止，并能在含200μM药物浓度的培养基中稳定生长，历时约8个月成功建成耐药株DLD-1/5-Fu。光学显微镜下示亲本和耐药株在形态上有明显差异，耐药株细胞形态不规整，呈分支状，胞内似乎有颗粒状物，但细胞大小相似。CCK-8法测得耐药株比亲本细胞生长增殖缓慢，两者的倍增时间分别为50.35±2.88h和42.61±2.17h，P＜0.05。CCK-8法测得耐药株的IC50为985.43±163.64μM，而亲本细胞株的IC50为7.65±3.22μM，DLD-1/5-Fu的耐药指数（RI）高达128.81，两者比较有显著差异（P＜0.01）。流式细胞术显示耐药株中的G0/G1期细胞数增多，而S期和G2/M期细胞数减少，其中G0/G1和G2/M期在两株中比较有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术显示耐药株中的CD133+细胞比例低于亲本细胞，两者比较有统计学意义（P＜0.05）。Western blot显示耐药株中P-gp和MGMT的蛋白表达量均显著高于亲本细胞株（P＜0.01），约为后者的两倍。RT-PCR显示耐药株中MGMT的mRNA的表达水平比亲本细胞高（P＜0.05），但增高幅度没有其蛋白水平明显。结论：成功建立人结肠癌细胞系DLD-1的5-Fu耐药株DLD-1/5-Fu，亲本细胞株和耐药株在对5-Fu的耐药性、形态学、倍增时间、细胞周期分布、肿瘤干细胞比例、多药耐药蛋白P-gp和DNA修复蛋白MGMT的表达上均存在差异，并提示肿瘤干细胞、多药耐药蛋白P-gp和DNA修复蛋白MGMT与结肠癌的5-Fu耐药存在相关性。