β3GnT8在结肠癌细胞株转移中的分子机制及转录因子c-jun对β3GnT8的调控作用

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目的:研究糖基转移酶β3GnT8在结肠癌细胞侵袭转移中的分子机制及探讨转录因子c-jun对β3GnT8的转录调控作用。方法:(1)Tranwell细胞迁移和侵袭实验分别检测LS-174T,SW620,SW480,LoVo四株结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。(2)Western-blot检测β3GnT8和CD147在四株结肠癌细胞中的蛋白表达水平。(3)流式细胞术和Lectin-blot检测四株结肠癌细胞株中多聚乳糖胺链的表达水平。(4)将β3GnT8的真核正义表达载体及空载体、β3GnT8干扰载体及对照载体通过脂质体分别介导转染至低转移的结肠癌细胞株LS-174T和高转移的结肠癌细胞株LoVo。(5)Western-blot检测转染后LS-174T中β3GnT8上调后和LoVo细胞中β3GnT8下调后CD147糖基化的改变。(6)Tranwell细胞迁移和侵袭实验检测转染后LS-174T中β3GnT8上调后和LoVo中β3GnT8下调后,其细胞迁移和侵袭能力的变化。(7)克隆转录因子c-jun全长基因序列并构建c-jun正义表达载体。(8)将c-jun真核正义表达载体及空载体通过脂质体转染胃癌SGC-7901细胞,并通过G418筛选稳转细胞株。(9)荧光显微镜观察转染荧光载体的细胞株,RT-PCR和Western-blot检测c-jun、β3GnT8和CD147的mRNA和蛋白表达;流式细胞术及Lectin-blot检测c-jun对细胞糖蛋白中多聚乳糖胺链的表达影响;细胞增殖和细胞周期实验检测转染c-jun后细胞增殖能力的变化。结果:(1)Transwell小室检测四株结肠癌细胞株中侵袭和迁移能力发现结肠癌细胞株的转移能力从低到高依次为LS-174T,SW620,SW480,LoVo。(2)Western-blot检测发现随着结肠癌转移程度的增加,β3GnT8和HG-CD147的表达也随之升高,且β3GnT8和HG-CD147的表达具有一定的相关性。(3)流式细胞术和Lectin-blot实验结果显示,多聚乳糖胺链的表达也随着结肠癌转移程度的增加而升高,并且被多聚乳糖胺链修饰的CD147糖蛋白的分子量大小在49kDa-90kDa之间。(4)LS-174T中β3GnT8上调后,与空白对照组相比,HG-CD147的糖基化表达升高,其侵袭和迁移能力也增强;LoVo细胞中β3GnT8下调后,与空白对照组相比,HG-CD147的糖基化表达下降,其侵袭和迁移能力也降低。(5)构建c-jun正义表达载体,正反向测序结果在NCBI基因库中BLAST同源检索后显示正义载体中插入的c-jun目的片段正确(6)通过荧光显微镜观察、RT-PCR、western-blot等检测,c-jun正义表达载体成功转入细胞并得到稳定转染细胞株SGC-7901。(7)Western-blot检测发现,c-jun基因上调后,与对照组相比β3GnT8和HG-CD147的表达均升高。(8)细胞增殖和细胞周期实验检测发现,c-jun基因上调后,与对照组相比细胞增殖能力增强。结论:(1)四株结肠癌细胞株的转移能力从低到高依次为LS-174T,SW620,SW480,LoVo。(2)β3GnT8、多聚乳糖胺链、HG-CD147的表达水平随着结肠癌转移程度的增加而升高,并且β3GnT8与HG-CD147的表达呈正相关。(3)在结肠癌细胞中β3GnT8可能通过调节HG-CD147的糖基化水平来影响其侵袭转移能力。(4)筛选出c-jun上调表达的SGC-7901稳转细胞株。(5)转录因子c-jun可能通过促进糖基转移酶β3GnT8的表达来影响糖蛋白HG-CD147的糖基化水平进而促进细胞的增殖能力。
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