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毛色是毛用动物重要的经济性状之一,毛色的研究将有助于提高毛用动物经济价值,减少因染色加工带来的工业污染和人体损害。然而,毛色的形成以及色素的沉着是受复杂的机制调控的,其中调控基因多达上百个。而在这些调控基因中,POMC尤为重要,它对黑色素的形成、发育以及沉着等各方面起着重要的调控作用。POMC表达量的变化或者基因突变将会导致下游色素生成酶的变化,从而影响毛色的形成。MicroRNA (miRNA、miR)是真核生物中发现的一类具有内源性调控功能的非编码小RNA,它可以通过与靶基因mRNA的3’-UTR退火结合而达到对靶基因mRNA的降解或阻碍其翻译的转录后调控。通过的TargetScan预测软件,发现POMC和miR-488存在一定的靶向关系,预测POMC是miR-488的靶基因。为此,我们提出假设miR-488可能通过与POMC的的3’-UTR结合达到对POMC转录后的调控,从而控制毛色的形成和色素沉着。实验通过对黑色素生成通路进行调控分析,构建POMC的3’-UTR双荧光报告载体鉴定POMC和miR-488之间的靶向关系,确定miR-488通过和POMC的3’-UTR结合调控POMC的mRNA的转录后调控；并进行miR-488真核表达载体构建以及小鼠角质形成细胞转染,确定其在细胞水平的调控方式。研究可以揭示miR-488在动物毛色形成过程中的作用机制。1.经NCBI中blast发现人、小鼠、牛、羊等物种的miR-488同源性极高,为94%-100%。通过TargetScan (http://www.targetscan.org/)预测miR-488与POMC的靶向关系。结果显示人、小鼠、羊miR-488与POMC皆具有靶向关系,且miR-488与POMC的3’-UTR结合位点一致,位于POMC的146-152之间的7个碱基,通过以上显示,我们初步判定POMC是miR-488的靶基因。2.取小鼠皮肤组织,提取总RNA。设计POMC以及miR-488引物,运用PCR鉴定其在小鼠体内内源性的表达。结果显示POMC和miR-488在小鼠体内均有表达。3.提取不同毛色小鼠RNA,反转录后经过荧光定量PCR鉴定POMC和miR-488在mRNA的表达,验证其内在的表达差异。结果发现POMC和miR-488的表达成负相关,当miR-488表达量高时,POMC相对较低；而miR-488表达量低时,POMC反而较高。初步判断体内两者之间存在体内表达的相互影响关系。4.提取不同毛色小鼠蛋白,通过蛋白免疫印迹验证POMC在蛋白水平的表达差异。结果显示：不同毛色小鼠体内均有POMC蛋白的表达,且随小鼠毛色不同而出现蛋白水平表达的差异。5.设计分别含有酶切位点Sad和XbaI的POMC3’-UTR,接入有同样酶切位点的pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector,进行连接。同时合成pMSCVpuroGFP-miR488真核表达载体,两个载体分别转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定菌落质粒。将鉴定正确菌落摇菌,提取质粒,送公司测序。连接合成萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶与POMC的3’-UTR嵌合体质粒载体,当两个载体共转染至293T细胞后,如果miR-488可与POMC的3’-UTR互补结合,pmirGLO中的荧光素酶所编码蛋白的活性将会受到抑制,因此可以通过检测荧光素酶的发光强度测定miRNA与其靶基因mRNA之间的调控效果。结果显示共转染两个载体后,萤火虫荧光值下降,表明miR-488可通过与POMC的3’-UTR结合,而影响双荧光报告载体上游萤火虫荧光素酶序列的表达,说明POMC和miR-488之间为靶标关系。6.培养小鼠原代角质形成细胞,将合成的pLV.ExBi.P/Puro-K14-MCS-mouse pri-miR488-MCS-eGFP真核表达载体转染于稳定遗传的小鼠角质形成细胞,由于K14启动子可选择性在角质化细胞表达,因此,可通过荧光显微镜观察GFP蛋白的表达来确定转染效率。提出转染后细胞总RNA,设计miR-488、POMC引物,进行RT-PCR,检测其mRNA水平量的变化。同时,用western bolt检测POMC、在蛋白水平的变化。结果表明转染miR-488后的角质细胞内POMC在mRNA和蛋白水平的表达均表现下降趋势,而蛋白水平的变化更为显著。综上所述：通过双荧光报告载体实验检测,我们可以确定POMC为miR-488的靶基因,miR-488可以通过与POMC mRNA的3’-UTR退火结合以达到对POMC mRNA的降解或阻碍其翻译的转录后调控,从而影响POMC下游信号转导。将miR-488转染小鼠角质形成细胞后,我们发现其会影响POMC的转录,确定miR-488可在细胞水平参与色素沉着。研究结果可丰富有关哺乳动物毛色形成机制的理论知识,也为建立基于miRNAs遗传修饰改良毛色的基因工程新策略提供重要的基因资源和实验依据。