抗体技术广泛应用于科研分析、疾病诊断与治疗等应用,这些应用依赖于高纯度与活性的抗体制剂。抗体分离纯化技术发展至今,亲和层析法的使用最为广泛,亲和层析中配体应具有对靶标分子的亲和力、特异性及稳定性。单域重链抗体(variable domain of heavy-chain antibodies,VHH)也称为纳米抗体是仅由重链可变区组成的最小抗原结合片段,具有分子量小、水溶性高、稳定性强等优点,因此具有广阔的应用前景。同时配体的固定化方法也是免疫亲和柱制备的关键因素,配体的随机固定化可能会导致配体活性降低,而定向固定化则能增加靶分子与配体结合的可能性。Halo-tag是一种蛋白质标签衍生于紫红红球菌的脱卤素酶,其能以共价键形式与相应配体结合。本研究基于以上背景,制备了定向和非定向两种抗Fc纳米抗体免疫亲和柱,探究和优化免疫亲和柱的制备及使用条件,主要研究结果如下:1.纳米抗体T9(Nb-T9)原核表达及非定向偶联抗Fc免疫亲和柱的制备。利用大肠杆菌原核表达系统表达Nb-T9,并通过镍柱纯化得到20 KDa左右的目的抗体,同时通过间接ELISA确定了Nb-T9与小鼠IgG的结合活性;并优化了非定向偶联最佳反应条件,其中最优活化体系为EDC:NHS=3:1,活化反应时间为2 h,偶联反应体系中缓冲液最优pH=7,抗体偶联时间为4 h;通过Braford法测定最终偶联量为6 mg/mL。同时对免疫亲和柱使用过程中的缓冲液进行了优化,确定了平衡缓冲液最优NaCl浓度为137 m M,pH=7.5,洗脱缓冲液(Gly-HCl)pH=3.5。2.Halotag-T9融合蛋白的原核表达、亲和常数的测定及定向偶联抗Fc免疫亲和柱的制备。采用基因重组技术成功构建了Halotag-T9原核表达载体pET30a(+)Halotag-T9,单因素实验优化后确定了最优表达条件为:0.5 mM IPTG,30℃诱导表达12 h。采用生物膜干涉技术分别对重组表达蛋白Nb-T9、Halotag-T9与小鼠IgG抗体的结合动力学参数进行测定,其中Nb-T9和Halotag-T9分别对小鼠IgG抗体的平衡解离常数(K_D)分别为8.32×10~-88 M和1.35×10~-77 M;制备的定向偶联免疫亲和柱抗体最终偶联量为5.1 mg/mL,对小鼠IgG的最大静态吸附量为8.28 mg/mL。3.非定向与定向偶联抗Fc免疫亲和柱性能的比较。通过比较对小鼠IgG最大静态吸附量发现定向免疫亲和柱比非定向免疫亲和柱高30%左右;两种免疫亲和柱重复使用10次后目标产物的IgG回收率都能达80%左右,37℃环境中放置7天后IgG回收率仍能达到80%。