研究背景：手性化合物的分离对药理、药效学的研究以及保证用药安全具有重大意义。本研究的顺利进行建立在课题组前期研究的工作基础上(实验室已制备了抗人参皂苷Rhl,抗人参皂苷Re及抗柚皮苷的单克隆抗体),旨为手性化合物、结构类似物的分离提供一种新的、值得深入探索的技术手段。研究目的：(1)利用人参皂苷Rhl单克隆抗体免疫亲和色谱柱一步法快速分离S型与R型人参皂苷Rg2；(2)利用人参皂苷Re单克隆抗体免疫亲和色谱柱一步法快速分离S型与R型人参皂苷Rhl；(3)考察并优化柚皮苷免疫亲和色谱柱敲除条件,建立柚皮苷免疫亲和色谱柱敲除过程在线检测方法；(4)利用柚皮苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱快速分离柚皮苷和橙皮苷,柚皮苷和新橙皮苷。为分离手性化合物、结构类似物的分离研究提供一种新的思路与方法。实验方法：(1)S型与R型人参皂苷Rg2的拆分研究：利用辛酸法纯化抗人参皂苷Rh1单克隆抗体,并制备免疫亲和色谱柱,配制不同浓度比的S型与R型人参皂苷Rg2混合溶液,利用该免疫亲和色谱柱对两者吸附能力的差异,对S型与R型人参皂苷Rg2进行拆分,利用HPLC对拆分前后样品进行分析。(2)S型与R型人参皂苷Rhl的拆分研究：利用辛酸法纯化抗人参皂苷Re的单克隆抗体,并制备免疫亲和色谱柱,利用该免疫亲和色谱柱对S型与R型人参皂苷Rhl吸附能力的差异,对配制的不同浓度比的两种人参皂苷Rhl进行拆分,利用HPLC对拆分前后样品进行分析。(3)柚皮苷免疫亲和色谱柱敲除过程在线检测方法的建立与条件考察：考察优化柚皮苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱的洗脱条件,包括结合缓冲液的种类及流速,洗脱缓冲液的种类、pH值、盐离子浓度及流速等条件。(4)柚皮苷与橙皮苷、新橙皮苷的分离研究：利用柚皮苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱快速分离柚皮苷与橙皮苷,柚皮苷和新橙皮苷,建立能够同时检测这三种成分的HPLC方法,对分离前后样品检测分析。实验结果：(1)s型与R型人参皂苷Rg2的拆分研究：本实验成功制备了人参皂苷Rhl的免疫亲和色谱柱,分析5个不同浓度比的S型与R型人参皂苷Rg2混合溶液上样前及分离后的HPLC色谱图,结果表明,人参皂苷Rhl免疫亲和色谱柱对S型人参皂苷Rg2的特异性吸附能力强于R型人参皂苷Rg2,随着混合溶液中S型人参皂苷Rg2浓度的增加,该免疫亲和色谱柱对S型人参皂苷Rg2的结合能力增强,当两者浓度比达到10：1时,洗脱液中只有S型人参皂苷Rg2,两个手性化合物达到了分离。(2)S型与R型人参皂苷Rh1的拆分研究：本实验成功制备了人参皂苷Re的免疫亲和色谱柱,并应用于S型与R型人参皂苷Rhl的敲除与分离。当单独敲除S型与R型人参皂苷Rhl时,该免疫亲和色谱柱对R型人参皂苷Rhl敲除率极低(2.92%),分析不同浓度比的S型与R型人参皂苷Rhl混合溶液上样前及分离后的HPLC色谱图,结果表明,当混合溶液中S型与R型人参皂苷Rhl含量分别为0.2mg/mL, 0.1mg/mL时,洗脱液中只有S型人参皂苷Rhl,两者达到了分离。(3)柚皮苷免疫亲和色谱柱在线检测方法的建立与条件考察：本实验利用蛋白纯化系统成功实现了免疫亲和色谱技术从离线分析向在线分析的转化,同时初步优化了柚皮苷免疫亲和色谱柱的工作条件：以水为结合缓冲液,以pH 3的Glycine-HCl为洗脱缓冲液,样品上样后孵育30分钟,以2 mL/min的流速进行实验。(4)柚皮苷与橙皮苷的分离研究：本实验利用柚皮苷免疫亲和色谱柱实现了柚皮苷与橙皮苷的一步法快速分离。(5)柚皮苷与新橙皮苷的分离研究：当柚皮苷与新橙皮苷的含量分别为0.15 mg/mL, 0.3 mg/mL,上样量为1 mL时,柚皮苷全部被该免疫亲和色谱柱敲除,敲除液中只有新橙皮苷,从而实现了柚皮苷与新橙皮苷的一步法分离。结论：本实验利用免疫亲和色谱柱分别探索分离了S型与R型人参皂苷Rg2,S型与R型人参皂苷Rhl,柚皮苷与橙皮苷,柚皮苷与新橙皮苷,为手性化合物及分离较困难的结构类似物的分离提供一种新的思路和方法,对手性化合物的分离方法、手性填料的研究具有十分重大的意义。同时,本实验利用蛋白纯化系统建立的免疫亲和色谱柱在线分析方法为免疫亲和色谱与其他色谱的联用技术奠定基础。