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背景与目的放射治疗是一种疗效确切的局部治疗手段,在非小细胞肺癌的全程治疗中发挥着重要的作用。但是由于放疗抵抗造成的肿瘤局部复发和肿瘤进展仍是放疗失败的主要原因之一。探索非小细胞肺癌放疗中,是否发生代谢重编程及其调控机制,有助于阐明非小细胞肺癌放疗抵抗的代谢机制,寻找有效的放疗增敏的新靶点,克服临床上NSCLC放疗抵抗现象。实验方法1、我们采用临床常规剂量分割方式,对三株人肺癌细胞株A549,H520,H460进行多次连续重复等差剂量梯度(2Gy×20F、2Gy×30F、2Gy×40F)照射,各剂量组细胞稳定传代后得到三个等差剂量组细胞系。采用平板克隆形成实验、EDU细胞增殖实验、中性彗星实验以及γ-H2AX免疫荧光染色实验检测细胞放疗敏感性。2、构建NSCLC腺癌细胞系A549、鳞癌H520的裸鼠皮下瘤。随机分为放疗组(接受放射治疗,10Gy/5F)及对照组,观察记录瘤体积变化,总结放射线治疗裸鼠皮下移植瘤的瘤体变化规律。3、取两株亲本/放射抵抗细胞株H460、H460-40F和H520、H520-40F,并取对照组、放疗结束、放疗结束后三天的三个时间点的小鼠皮下瘤,提取总RNA后,进行转录组测序,检测各组差异基因表达并进行GO功能聚类分析。综合体内外的转录组测序结果,寻找放疗作用过程中最有可能发生代谢重编程引起放疗存活/抵抗的代谢通路。4、通过Western blotting验证体外测序关键代谢靶点的表达情况。通过TCGA数据库分析脂肪酸代谢中脂肪酸β氧化限速酶CPT1A以及甘油酯代谢限速酶ATGL和脂肪酸合成限速酶FASN表达与NSCLC预后的关系;油红O染色检测脂质储存能力;以及Seahorse实验检测细胞耗氧率(OCR)。分别采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir以及脂肪甘油三酯脂肪酶抑制剂Atglistatin干预后进一步检测细胞放射敏感性及增殖效率。5、进一步对辐射抵抗及亲本细胞系转录组测序的KEGG通路分析,通过Western blotting验证体内外测序的信号通路表达情况。过表达和敲降JAK2后,通过和Western blotting验证脂代谢靶点ATGL和CPT1A的表达情况。荧光素酶报告实验以及染色质免疫共沉淀技术验证JAK2/STAT3对脂代谢靶点ATGL和CPT1A的转录调控作用。应用JAK2小分子抑制剂AZD1480后,Western blotting验证对脂代谢关键酶的表达影响;油红O染色以及Seahorse实验检测AZD1480对脂代谢功能的调控作用;平板克隆形成实验、EDU细胞增殖实验检测AZD1480干预后NSCLC细胞的放射敏感性及增殖效率。实验结果1、我们成功建立了 A549、H520、H460常规分割等差剂量梯度辐射存活/抵抗的肺癌细胞模型;在A549、H520、H460及其衍生细胞系中,各等差剂量梯度辐射存活/抵抗细胞株的放射抵抗性、增殖率呈接受过的辐射剂量依赖性增加;与亲本细胞相比,随着细胞接受过的辐射剂量的增加,DNA双链断裂(DSB)逐渐降低,提示对放射线造成的损伤越来越耐受。体外成功构建了 A549和H520裸鼠皮下成瘤放射治疗模型,并总结了放射线治疗与裸鼠皮下瘤生长之间的大体规律:即放疗(2Gy×5)结束时瘤体积增加最显著,随后开始出现肿瘤体积的缩小,在放疗结束后第3天肿瘤体积维持不变或开始增大。动物及细胞转录组测序结合综合分析表明:不同剂量照射后的肺癌细胞出现的基因表达差异经GO功能聚类富集在各类脂代谢、糖代谢、JAK/STAT、MAPK以及TGFβ等信号通路。2、通过Western blotting验证糖、脂代谢蛋白的表达转录组测序一致。TCGA数据分析获得的生存曲线提示脂肪酸代谢通路的关键基因:CPT1A、ATGL及FASN高表达与NSCLC不良预后相关。在常规分割等差剂量梯度辐射存活/抵抗的肺癌细胞模型中,油红O染色显示各剂量辐射存活/抵抗细胞与亲代细胞比较,脂肪沉积均明显增多,呈剂量依赖性增加。细胞耗氧率(OCR)随接受过的照射剂量的增加而增加。Etomoxir以及Atglistatin干预后逆转了抵抗细胞的辐射敏感性及增殖效率。3、进一步对辐射抵抗及亲本细胞系转录组测序进行KEGG通路分析,通过Western blotting验证体内外测序的信号通路表达情况。过表达和敲降JAK2后,通过和Western blotting验证脂代谢靶点ATGL和CPT1A的表达情况。荧光素酶报告实验以及染色质免疫共沉淀技术验证JAK2/STAT3对脂代谢靶点ATGL和CPT1A的转录调控作用。应用JAK2小分子抑制剂AZD1480后,Western blotting验证对脂代谢关键酶的表达影响;油红O染色以及Seahorse实验检测AZD1480对脂代谢功能的调控作用;平板克隆形成实验、EDU细胞增殖实验检测AZD1480干预后NSCLC细胞的放射敏感性及增殖效率。实验结论1、我们建立了等差剂量辐射抵抗细胞株,为探索肺癌辐射抵抗的机制提供了临床前研究模型。2、辐射剂量依赖的脂代谢重编程增强可以促进NSCLC细胞放疗抵抗。3、放疗激活NSCLC细胞中的JAK2/STAT3信号通路;JAK2/STAT3通过转录上调NSCLC细胞脂代谢关键酶ATGL和CPT1A。4、小分子抑制剂靶向JAK2/STAT3通路及脂代谢关键酶可以有效增敏放疗,这可能是逆转NSCLC放疗抵抗的潜在治疗方式。