基于纳米材料的微囊藻毒素免疫传感器的制备

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微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由蓝藻产生的分布广、危害严重的藻毒素类型,具有多器官毒性、遗传毒性和致癌性。MCs不仅污染饮用水源,而且会进入鱼虾等水生动物体内,通过食物链在人体内富集,对人类健康造成危害。其中国标饮用水手册规定MC-LR的浓度不能超过1μg/L,因此对水源水中MC-LR的检测和监控对于保障水体安全具有重要意义。传统的仪器分析检测法虽具有较好的分析灵敏度,但由于仪器昂贵而笨重,仪器操作步骤繁琐,并且需要专门的技术人员,限制了其广泛应用。因而迫切需要研究人员建立一种简便、快速、灵敏度较高的检测方法,以对水体中的MCs进行监控。免疫传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、可在复杂体系中连续监测等优点。近年来,随着纳米科技的飞速发展,纳米材料的各种特殊的物理、化学性质逐步被发掘,例如优秀的导电性能,化学稳定性,比表面积,良好的生物相容性等,其应用正不断拓展到化学、生物、医学等领域的各个方面。纳米材料与生物传感技术的结合,可有效提高免疫传感器的分析性能。本文以MC-LR作为分析检测对象,合成了多种功能化的纳米复合材料,把纳米复合材料应用到MCs免疫传感器的构建中,结合相应的核酸信号放大技术,实现了对MC-LR的高选择、快速、灵敏检测,并在实际水样中的检测中表现出很好的准确性。本论文的主要工作如下:(1)基于Fe3O4@PDA/RGO和RCA信号放大的电化学免疫传感器的构建在本工作中,我们通过水热法合成了磁性石墨烯(Fe3O4@PDA/RGO)基底材料,同时,以金纳米棒作为二抗和引物DNA的载体,构建了一种多酶标记的电化学免疫传感器。借助球形四氧化三铁(Fe3O4)大的表面积和聚多巴胺(PDA)优秀的粘附能力,大量的MC-LR抗原可以被固定到ITO电极表面。免疫反应完成后,引物DNA可触发滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)反应,形成具有重复结构的长链DNA重复单元,负载更多的信号分子ST-HRP,以增加分析测试的响应电流,提高传感器的灵敏度。该免疫传感器对MC-LR的线性检测范围为0.01-50μg/L,检出限可达0.007μg/L(S/N=3)。(2)基于AuNP-CNT和HCR诱导铜纳米颗粒的双信标电化学免疫传感器的构建在本工作中,以一步法合成的金纳米颗粒-碳纳米管(AuNP-CNT)复合材料作为基底材料,以银纳米颗粒/金纳米棒(AgNP/AuNR)作为二抗和杂交链扩增引物的载体,构建了一种双信标电化学免疫传感器。AuNP-CNT具有良好的生物相容性和强的蛋白亲和能力,有利于抗原稳定附着在其表面。AgNP/AuNR标记物上的引物DNA可以触发杂交链反应(hybridization chain reaction,HCR),形成长的双链DNA,双链DNA可作为铜纳米颗粒的生长模板。AgNP/AuNR纳米材料中的银纳米颗粒以及HCR产物上的铜纳米颗粒,经硝酸溶解后,在差分脉冲溶出伏安法(differential pulse stripping voltammetry,DPSV)测试下可以出现两个电流峰。双信号输出有利于增强检出灵敏度和降低分析测试的检出限,该免疫分析对MC-LR的检出限可达到2.8 ng/L(S/N=3)。(3)基于双链DNA-铜纳米颗粒荧光适配体传感器的构建在本工作中,以核酸适配体为识别元件,构建了一种更加简便、快速的荧光适配体传感器。当适配体和互补链存在时,可以互补配对成双链DNA,双链DNA可以作为荧光纳米铜的生长模板,检测体系有较强的荧光。若存在目标物MC-LR,MC-LR与适配体特异性结合,使双链DNA的数量减少,体系的荧光下降,从而实现对MC-LR的快速定性定量。该荧光适配体传感器对MC-LR的线性检出范围为0.5-500μg/L,检出限为0.1μg/L,尽管检出限比电化学分析方法的略高,但简便的构建过程可为传感器的小型化、便携化提供一定的理论支撑。
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