乙酰化EGCG的酶法制备及其在油脂中抗氧化应用研究

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表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶茶多酚中质量分数最大的一种成分,约占茶多酚总量的30%~40%。EGCG具有抗氧化、抗突变、防辐射、抗肿瘤、调节免疫和延缓衰老等生理活性作用。然而由于EGCG较高的水溶性和较低的脂溶性,大大限制了它作为天然抗氧化剂和医药、保健原料的潜在应用,尤其是在精炼食用油脂中的应用。本文利用酶法制备乙酰化EGCG以期增加其脂溶性,并对乙酰化EGCG的反应条件、分离条件及乙酰化EGCG在食用油中的溶解性和抗氧化活性等进行了研究。主要研究内容包括:确定了酶法制备乙酰化EGCG的最优反应条件:酶的种类为脂肪酶TLIM,反应溶剂体系为乙腈:异丙醇=5:5,反应温度为45℃,反应时间为11h,底物摩尔比(乙酸乙烯酯与EGCG物质的量之比)为0.4:1,脂肪酶添加量为5%(w/w,酶:底物)。在此条件下,EGCG的乙酰化转化率为96.73%。采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)和红外光谱对EGCG乙酰化产物进行了确证。通过对EGCG反应前后红外图谱进行对照分析,发现反应后产物具有明显的羰基(C=O)吸收峰,说明乙酰化反应是成功的。LC-MS/MS进一步确认该产物是一种混合物,根据乙酰基取代数目的不同,分为一取代、二取代和三取代三类产物,每类取代产物由于取代位置的不同,又分为不同的单体。利用高速逆流色谱法(HSCCC)分离乙酰化EGCG粗产品,并确定了分离条件:溶剂系统为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1.5:5:1.5:5(v/v),上相为固定相,下相为流动相,正向旋转,转速为700r/min。将HSCCC分离得到的4个峰进行HPLC检测,可知峰2为纯度达到93.52%的EGCG乙酰化一取代产物,经过质谱和核磁共振分析,确定该产物为5’-O-乙酰基EGCG。通过溶解度和透光率实验表明,乙酰化EGCG在食用油中溶解性较好,透明度较高,在30℃时溶解度为0.50g/kg。色差实验表明在添加量为200mg/kg时,乙酰化EGCG对于大豆油色泽、亮度没有显著影响。采用过氧化值(POV)法考察并比较了不同抗氧化剂在食用油中的抗氧化性能。结果表明,在添加量同为200mg/kg时,乙酰化EGCG在油脂中的抗氧化活性要高于未改性EGCG和BHT,略低于TBHQ。而对于不同取代度的乙酰化EGCG产物,其抗氧化活性顺序为:乙酰化一取代产物>一取代和二取代的混合产物>乙酰化EGCG混合物>未改性EGCG。清除DPPH自由基能力比较结果为VC>EGCG>乙酰化EGCG>TBHQ。
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