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肢蹄问题是制约种猪生产力并且导致生产母猪淘汰的主要原因之一,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。猪的胫骨起到支撑重量的重要作用,其正常的发育才能保证种猪肢蹄的基本健康,因此对于胫骨发育的研究显得尤为重要。影响肢蹄问题的因素有很多,其中遗传因素被认为是主要影响因素,但是目前导致种猪肢蹄问题的相关分子遗传机制尚未清晰。本课题组前期工作引入骨密度测量技术测定了肢蹄结实度相关性状,证实肢蹄结实度具有中等遗传力,但不同品种的骨分子遗传机制是否存在差异尚不清楚。本研究通过采集杜洛克、长白和大白仔猪1日龄和28日龄的右侧胫骨进行组织切片观察,采集血液进行血清骨特异性标记物的分析,采集左侧胫骨组织样进行RNA-seq测序并通过转录组分析技术鉴定两个时期间的差异表达基因,揭示影响胫骨发育的分子机制。主要试验结果如下:(1)通过对1日龄和28日龄的胫骨切片进行苏木精-伊红染色法(HE)染色观察,综合三个品种仔猪胫骨切片的观察结果,本研究发现28日龄仔猪骨皮质层密度略高于1日龄,骨小梁密度低于1日龄。因此本研究推断28日龄的仔猪胫骨外表更坚硬,但对于外应激力的抵抗能力较1日龄有所下降。(2)通过全自动血清生化分析仪对骨形成的标记物碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)进行测定分析,杜洛克仔猪在1日龄时ALP浓度为1272.822±103.809 U/L,在28日龄时浓度为332.567±16.351 U/L,28日龄的ALP浓度极显著低于1日龄(P<0.001);长白仔猪在1日龄时ALP的浓度为1712.000±309.902 U/L,在28日龄时的浓度为415.522±116.657 U/L,28日龄时的ALP浓度极显著低于1日龄(P<0.01);大白仔猪在1日龄时ALP浓度为1223.478±362.268 U/L,在28日龄时的浓度为371.389±126.393 U/L,28日龄时的ALP浓度显著低于1日龄(P<0.05)。通过ELISA对骨吸收的标记物I型胶原C端肽(C-terminal telopetide of type I collagen,CTX)进行测定发现,杜洛克仔猪1日龄时CTX浓度为16.41±1.14 nmol/L,28日龄时CTX浓度为15.09±2.08 nmol/L;长白仔猪1日龄时CTX浓度为13.39±0.30 nmol/L,28日龄时CTX浓度为15.45±0.73 nmol/L,28日龄的CTX水平显著高于1日龄(P<0.05);大白仔猪1日龄时CTX浓度为17.97±1.45 nmol/L,28日龄时CTX浓度为18.31±2.47 nmol/L。根据对血清生化指标测定的结果综合分析,本研究认为仔猪胫骨在1日龄到28日龄发育过程中,骨的发育主要是由骨形成的水平变化影响调控的,而骨吸收方面影响较小。(3)通过构建三个品种仔猪胫骨1日龄和28日龄的转录组图谱进行对比分析。在杜洛克不同日龄仔猪胫骨数据对比中发现了555个差异表达基因,而对这些差异表达基因进行通路富集,发现主要富集在了矿物质吸收、类风湿性关节炎和c GMP-PKG信号通路等通路;在长白不同日龄仔猪胫骨数据对比发现了563个差异表达基因,对这些差异表达基因进行通路富集,发现主要富集在了金黄色葡萄球菌感染、类风湿关节炎、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路,所富集到的通路与杜洛克仔猪差异表达基因的富集结果类似。在大白不同日龄仔猪胫骨数据对比中共发现1257个差异表达基因。对这些差异表达基因进行通路富集,发现主要富集在了PI3K-Akt信号通路,PPAR信号通路等通路。而三个品种时期间的差异基因在GO富集方面主要富集在了钙离子稳态细胞和对白细胞介素-1的反应等功能上。(4)通过对三个品种内的差异表达基因按照差异程度排序,取差异程度最为显著的前二十基因,参考NCBI数据库和相关文献,挑选与骨发育紧密相关的基因作为重要候选基因。在本研究中可以发现REG4、SLC13A2、ACTC1和MIR133A-2为影响杜洛克仔猪胫骨发育的重要候选基因;IL1RAPL2、RSAD2、ISG15、ANGPTL5、HES7、MX1和CYP24A1为影响长白仔猪胫骨发育的重要候选基因;RBM46、IL1RAPL2、TRH、SDR16C5、CAV3和CLDN3为影响大白仔猪胫骨发育的重要候选基因。(5)本研究通过加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)将基因根据表达模式分为不同的模块,对1日龄、14日龄和28日龄的转录组数据以时期作为特征进行相关性分析,发现了两个与时期相关性较强的模块。通过筛选Hub基因并查阅相关文献,发现其中IFI44L、GHSR、CMPK2、MX1和DDX58对成骨、破骨以及骨骼发育具有一定的影响,因此本研究认为这些基因在三个品种仔猪胫骨的发育中起到重要的作用。并且三个品种差异表达基因所富集的通路中金黄色葡萄球菌感染和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路为共有通路,所以本研究认为其在调控三个品种仔猪胫骨发育过程中起到重要作用。(6)在三个品种共有的差异表达基因中挑选出5个基因进行RT-q PCR验证,RT-q PCR的结果与转录组分析得到的结果相似,变化趋势相同。对转录组分析得到的差异倍数与RT-q PCR得到的差异倍数进行回归分析,结果显示R~2为0.8左右,验证结果表明数据和分析结果具有可信度。综上所述,本研究通过切片观察和血清生化指标分析对不同时期仔猪胫骨的特征进行了鉴定,并通过对胫骨测序数据的挖掘,鉴定出了影响仔猪胫骨发育的重要候选基因并注释其功能。本研究为揭示调控仔猪胫骨发育的分子机制提供参考,也为改善种猪肢蹄性状的育种工作提供了理论依据。