研究背景及目的:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,也是导致世界范围内疾病死亡的重要原因之一。根据肺部肿瘤的生物学特性、对于化疗的反应性以及预后特点,世界卫生组织将肺癌划分为小细胞肺癌（small cell lung cancer）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）,其中非小细胞肺癌是最常见的肺癌亚型,占所有肺癌的80-85%。虽然针对肺癌的诊断技术和治疗方法不断在进步和改善,I期和II期患者早期治愈率会显著提高,但是流行病学资料显示非小细胞肺癌的早期诊断率仅为16-30%,对于大多数非小细胞肺癌患者发现和确诊即为晚期（IIIb和IV期）,无法再进行根治性手术,预后及生存质量均较差,中位生存期仅为8-10个月,2年和5年生存率分别约为20%和15%,所以寻找早期敏感的基因标志物对非小细胞肺癌进行早期诊断和监测,以及提高患者预后和延长生存时间具有十分重要的临床意义,这也是近年来肺癌临床和基础研究关注的重点和热点。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（Poly ADP-ribose polymerase-1,PARP-1）又称腺苷二磷酸-核糖基转移酶（adenosine diphosphate ribosyl transferases-1,PART-1）,是广泛存在于大多数真核细胞内的蛋白核酶,能够通过酯键将ADP-核糖聚合物连接至靶蛋白基序上并触发一系列重要的细胞生物学功能,例如维持染色质结构的稳定性、DNA的损伤修复、转录调控、细胞凋亡、坏死、分化等生理过程,以保证最佳的细胞稳态。但是当细胞遭受过度的应激刺激后,PARP-1的过度激活或激活时程的病理性延长会导致β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和三磷酸腺苷（ATP）的减少,线粒体凋亡蛋白和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）的释放,进而触发下游的细胞坏死级联反应。既往的研究发现PARP-1在肺腺癌中的表达显著上调,外源性的给与PARP-1抑制剂能够抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复,增加肿瘤细胞对药物的敏感性,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。与此同时,NF-κB作为生命体中一种重要转录因子,能够调控细胞因子、生长因子、黏附分子等多种基因的表达。在人体的正常细胞中,转录因子NF-κB通常与一种抑制性蛋白NF-κBI结合,以无活性的形式存在于细胞浆中,但是一旦受到外源性的刺激后,NF-κBI被蛋白水解酶磷酸化并发生降解后,对NF-κB的抑制性作用解除,NF-κB被激活后发生核转位。在细胞核中,NF-κB会与多种基因的启动子或增强子发生结合,调控多种生命活动密切相关基因的表达,例如细胞的修复、炎症反应的活化、肿瘤的始动和转移播散等,因此在不少的研究中都提及:NF-κB的选择性激活或过表达对于调控肿瘤细胞的凋亡具有重要作用。但是在非小细胞肺癌病情发生之初及进展过程中PARP-1和NF-κB的作用尚不明确,因此寻找凋亡、坏死和细胞周期通路上新的靶点对于提高非小细胞肺癌的临床诊断和治疗监测具有非常重要的现实价值,本研究旨在探讨PARP-1和NF-κB在中国人非小细胞肺癌发生发展中的作用及作用机制,利用免疫组化和蛋白质免疫印迹技术分析PARP-1和NF-κB在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织与癌旁组织中的表达变化,并通过检测PARP-1和NF-κBIα基因位点的单核苷酸多态性,分析其与患者的临床预后参数之间的相关性,寻找监测非小细胞肺癌病情发生发展的关键基因的易感多态及治疗的靶点基因,为非小细胞肺癌患者的临床诊断和预后判断提供理论依据。第一部分 基于免疫组化及免疫印迹技术检测PARP-1和NF-κB基因在非小细胞肺癌中的表达峰度并分析其与临床生存指标的相关性研究方法:收集安徽医科大学第一附属医院普胸外科2011年3月至2012年12月非小细胞肺癌患者的肺癌切除标本,包括54例癌组织和癌旁组织相匹配的组织标本,进行石蜡包埋后制备组织切片。采用免疫组化及免疫印迹技术检测PARP-1和NF-κB在肿瘤组织中的蛋白表达峰度。半定量分析:每个组织样本根据免疫组化的染色强度和染色范围进行半定量分析,染色强度分为四级评分:0=阴性,1=弱阳性,2=中等阳性,3=强阳性;染色范围分为5级:0=0%,1=1-10%,2=11-50%,3=51-80%,4=81-100%。将染色强度和染色范围的评分相乘获得免疫组化的积分（IHC积分）,若IHC积分≥6分则判断为该分子在肿瘤组织中高表达,<6分则认为该分子在肿瘤组织中低表达。通过对免疫印迹条带进行灰度扫描,并与内参比较进行免疫印迹图像的半定量分析。相关性分析:1.分析配对的肺癌组织和癌旁组织中PARP-1和NF-κB的表达水平的相关性及差异性。2.分析PARP-1和NF-κB的表达水平与患者的临床生存因素及病理分型之间的相关性。结果:1.利用配对的54例非小细胞肺癌患者的癌组织及癌旁组织进行免疫组化及Western blot分析PARP-1和NF-κB基因的蛋白表达水平,发现PARP-1和NF-κB基因在癌组织中发生显著性的表达升高,P<0.05。并且非配对的非小细胞肺癌组织及癌旁组织中PARP-1和NF-κB基因的表达也在两组之间存在的差异有统计学意义,P<0.05。2.Kaplan-Meier生存曲线分析和多变量Cox风险回归模型的分析发现:癌组织中的PARP-1高表达与非小细胞肺癌患者的总生存存在相关性,即PARP-1分子的高表达与肺癌患者较短的中位生存期相关,提示PARP-1可能是非小细胞肺癌患者的独立不良预后因子。结论:1.免疫组化及蛋白免疫印迹证实非小细胞肺癌组织及癌旁组织中PARP-1和NF-κB基因的表达存在显著差异,癌组织中PARP-1和NF-κB表达显著升高,2.肿瘤细胞中PARP-1和NF-κB基因的表达情况与患者的预后无疾病生存时间存在相关性,提示PARP-1不仅可以作为非小细胞肺癌患者的抗肿瘤治疗靶点,而且可以作为患者预后和病情发展的重要监测指标。第二部分 PARP-1和NF-κB基因的多态性与非小细胞肺癌发生发展的关系分析研究方法:收集安徽医科大学第一附属医院普胸外科210例非小细胞肺癌患者及280例健康对照个体的外周血及完整的临床病例资料,所有患者术前均未进行放化疗及免疫治疗。通过高盐DNA提取法提取患者外周血白细胞中的DNA,通过聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性技术（PCR-RFLP）对非小细胞肺癌患者外周血DNA中PARP-1和NF-κBIα基因多态性位点进行基因型分析,比较不同基因型与非小细胞肺癌发生发展、患者预后之间的关系。结果:1.在非小细胞肺癌组和对照组中PARP-1基因的1672位点和NF-κBIα基因的519位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则,本研究的抽样能够代表一般人群中PARP-1和NF-κBIα基因分布特点,具有普适性（P>0.05）。2.一般资料中吸烟史在非小细胞肺癌组和对照组之间的差异有统计学意义。非小细胞肺癌组具有吸烟史的患者有128例,占据60.9%,对照组中具有吸烟史的有76例,占据27.1%,两组研究对象的吸烟史分布比例有统计学差异（P=0.021）,病例组吸烟比例明显高于健康对照组。3.PARP-1-1672基因多态性在非小细胞肺癌组及对照组中的分布情况。PARP-1基因第1672位点野生型GG在健康对照组和非小细胞肺癌组中的频率分别为32.9%和16.2%;杂合突变型GA在两组中的频率分别为33.9%和50.5%;纯合突变在两组中的频率分别为33.2%和33.3%,Logistic回归分析发现PARP-1基因第1672位点的杂合突变型GA对非小细胞肺癌发病的影响具有统计学意义（P=0.003）,对应的OR=1.942,95%CI=1.481-2.310。证实该位点碱基的杂合突变可能会造成罹患非小细胞肺癌的危险性显著增加。4.NF-κBIα-519基因多态性在非小细胞肺癌组及对照组中的分布情况。NF-κBIα基因第519位点野生型AA在健康对照组和非小细胞肺癌组中的频率分别为32.1%和23.8%;杂合突变型AG在两组中的频率分别为34.3%和55.2%;纯合突变在两组中的频率分别为33.6%和21.0%,Logistic回归分析发现NF-κBIα基因第519位点的杂合突变型AG对非小细胞肺癌发病的影响具有统计学意义（P=0.004）,对应的OR=2.175,95%CI=1.881-2.509。证实该位点碱基的杂合突变可能会造成罹患非小细胞肺癌的危险性显著增加。5.分析PARP-1-1672位点基因的多态性与吸烟之间的交互作用。单独吸烟的OR值为1.971（95%CI=1.690-2.274）,对非小细胞肺癌的发病具有统计学意义,单独携带PARP-1-1672位点杂合突变GA基因型的OR值为1.942（95%CI=1.481-2.31）,对非小细胞肺癌的发病具有统计学意义,但是两者交互作用分析发现P值>0.05,提示PARP-1-1672位点杂合突变GA基因型与吸烟史在非小细胞肺癌的发生发展中并不存在交互作用。6.分析NF-κBIα-519位点基因的多态性与吸烟之间的交互作用单独吸烟史的OR值为1.971（95%CI=1.690-2.274）,对非小细胞肺癌的发病具有统计学意义,单独携带NF-κBIα-519位点杂合突变AG基因型的OR值为2.175（95%CI=1.881-2.509）,对非小细胞肺癌的发病具有统计学意义,两者交互作用分析发现:P=0.031,OR值=1.233（95%CI=1.011-1.548）,提示NF-κBIα-519位点杂合突变AG基因型与吸烟在非小细胞肺癌的发生发展中存在交互作用,NF-κBIα-519位点杂合突变AG基因型和吸烟史的交互作用,会导致罹患非小细胞肺癌的风险增加。7.分析PARP-1-1672位点与NF-κBIα-519位点基因多态性之间的交互作用在非小细胞肺癌发生发展中的作用。单独携带PARP-1-1672位点纯合突变AA型的OR值0.946（95%CI=0.813-1.207）,对于非小细胞肺癌的发生的影响无统计学意义,但是PARP-1-1672位点纯合突变AA型与单独携带NF-κBIα-519位点杂合突变AG型存在交互作用,两者同时作用时OR值为1.322（95%CI=0.398-1.804）,证实PARP-1-1672位点纯合突变AA型与单独携带NF-κBIα-519位点杂合突变AG型的交互作用使得罹患非小细胞肺癌的危险性显著增加。结论:1.在非小细胞肺癌组和对照组中PARP-1-1672位点和NF-κBIα-519位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则,本研究的抽样能够代表一般性人群中PARP-1和NF-κBIα基因分布特点;2.PARP-1-1672位点基因杂合突变型GA,该位点碱基的杂合突变会造成罹患非小细胞肺癌的危险性增加（P=0.003）;3.NF-κBIα-519位点基因杂合突变型AG,该位点碱基的杂合突变会造成罹患非小细胞肺癌的危险性显著增加（P=0.004）;4.NF-κBIα-519位点杂合突变AG基因型与吸烟在非小细胞肺癌的发生发展中存在交互作用,两者共同发生时会导致罹患非小细胞肺癌的风险增加;5.PARP-1-1672位点纯合突变AA型与NF-κBIα-519位点杂合突变AG型的交互作用使得罹患非小细胞肺癌的危险性显著增加