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目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetic mellitus,DM)最严重的并发症之一,同时也是导致终末期肾病的第二大病因。该病的发病机制尚不明确,近年来研究发现肾小球滤过屏障中足细胞的损伤是导致蛋白尿产生的重要因素之一,其上的P-钙粘素(P-cadherin)和瞬时受体电位阳离子通道-6(transient receptor potential canonical-6,TRPC6)是近期发现的与蛋白尿产生密切相关的蛋白。本实验旨在观察化瘀通络中药不同配伍对DKD大鼠肾脏干预作用和对肾组织P-cadherin和TRPC6表达的影响,进一步探索其可能的作用靶点。方法:将70只雄性SD大鼠,体重约为100±10g,随机分为正常组(C组,n=8)和造模组(n=62),采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量链脲佐菌素(streptozotion,STZ)腹腔注射法(35 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,72h后三次尾静脉取血测随机血糖(random blood glucose,RBG),均≥16.7mmol/L者即为模型制备成功,不符合标准者予以剔除。之后将成模的55只大鼠再随机分为模型组(M组)、化瘀通络中药组(Q组)、厄贝沙坦组(I组)、化瘀组(H组)和通络组(T组),每组11只,灌胃干预16周。分别于药物干预后的第3天、4周末、8周末、12周末、16周末,收集各组大鼠24小时尿液,测定24小时尿量和24小时尿蛋白定量(24h urinary total protein,24h UTP);测量RBG、饮水量、摄食量,观察其动态变化。在16周末,水合氯醛麻醉大鼠后开腹剥离双侧肾脏,称量肾重(kidney weight,KW),计算肾脏肥大指数(hypertrophy index,HI);腹主动脉取血待行血液生化指标检测;留取肾组织,待行光镜、电镜观察,运用免疫组织化学法(immunohistochemistry technique,IHC)、实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印迹法(Western Blot)进行m RNA和蛋白表达检测。结果:1各组大鼠的一般情况C组大鼠精神状态良好,活动灵活,摄食饮水尿量无异常,体重平稳增加。M组则精神逐渐萎靡,多饮多食多尿,体重较前减少。各治疗组较M组,上述症状不同程度缓解。2不同时间点各组大鼠24小时摄食量、饮水量、尿量动态变化与同一时间点C组相比,各造模组24小时摄食量、饮水量和尿量显著增加(P<0.05或P<0.01);与同一时间点M组比较,各治疗组摄食量在任何时间点均无差异(P>0.05);饮水量和尿量在第16周出现差异,与同时间点M组比较,Q组和T组24小时饮水量和尿量均减少(P<0.05或P<0.01),I组和H组无明显变化(P>0.05)。3各组大鼠肾重、体重及肾脏肥大指数比较各组大鼠肾重间无统计学差异(P>0.05)。与C组相比,各造模组体重显著降低,肾脏肥大指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与M组比较,Q组体重升高,肾脏肥大指数降低(P<0.01),则I组、H组和T组差异无统计学意义(P>0.05)。4各组大鼠24h UTP比较第3天,各组大鼠24h UTP组间无差异(P>0.05)。第4周末,与C组比较,各造模组大鼠24h UTP均上升(P<0.05),而各治疗组差异无统计学意义(P>0.05)。第8周末,与C组比较,各造模组大鼠24h UTP均上升(P<0.01);与M组比较,Q组和I组大鼠24h UTP下降(P<0.01),H组和T组无差异(P>0.05)。第12周末,与C组比较,各造模组大鼠24h UTP均上升(P<0.01);与M组比较,各治疗组大鼠24h UTP均下降(P<0.05或P<0.01)。第16周末,与C组比较,各造模组大鼠24h UTP均上升(P<0.01);与M组比较,各治疗组大鼠24h UTP均下降(P<0.05或P<0.01);与I组比较,Q组下降(P<0.05);与Q组比较,H组和T组稍高(P<0.05)。5各组大鼠随机血糖、血脂比较不同时间点C组大鼠RBG基本稳定;各造模组RBG均显著升高(P<0.01),且各造模组组间无差异(P>0.05)。与C组比较,各造模组大鼠胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇均升高(P<0.05或P<0.01)。与M组比较,各治疗组大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇均降低(P<0.05或P<0.01);高密度脂蛋白胆固醇方面,Q组和T组大鼠升高(P<0.01),I组和H组差异无统计学意义(P>0.05)。6各组大鼠血清蛋白和肾功能比较各组间总蛋白(total protein,TP)和白蛋白(albumin,ALB)差异无统计学意义(P>0.05)。与C组比较,M组大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)和尿酸(uric acid,UA)均升高(P<0.01);与M组比较,Q组、I组和T组大鼠BUN均降低(P<0.05或P<0.01),H组大鼠无差异(P>0.05),各治疗组大鼠Scr和UA均降低(P<0.05或P<0.01)。7肾脏形态学观察结果7.1光镜观察结果光镜下观察C组肾小球结构清晰。M组肾小球肥大,囊腔变窄,呈裂隙状,系膜基质增生堆积伴基底膜弥漫性增厚,肾小管排列紊乱。与M组比较,各治疗组不同程度改善。7.2透射电镜观察结果透射电镜下观察C组肾小球结构相对正常。M组结构紊乱,基底膜弥漫性增厚,足突出现变宽、扁平、甚至融合消失。与M组比较,各治疗组病理改变稍减轻。8免疫组化检测肾皮质P-cadherin、TRPC6的表达光镜下可观察到C组P-cadherin沿肾小球基底膜成线性分布,蛋白表达量较多;与C组比较,M组表达量明显较少;与M组比较,Q组、I组表达明显增加,H组和T组无明显差异。C组TRPC6表达微弱;与C组比较,M组TRPC6表达较强;与M组比较,各治疗组不同程度改善;各治疗组组间无明显差异。9 Real-time PCR检测各组大鼠肾皮质P-cadherin和TRPC6 m RNA的表达与C组比较,M组P-cadherin m RNA水平显著下调(P<0.01);与M组比较,Q组和I组P-cadherin m RNA水平明显上调(P<0.01),H组和T组则无明显上调(P>0.05);与Q组和I组比较,H组和T组相对降低(P<0.05或P<0.01)。与C组比较,M组大鼠TRPC6 m RNA表达水平升高(P<0.05);与M组比较,各治疗组大鼠TRPC6 m RNA表达相对降低(P<0.05);且各治疗组组间无统计学差异(P>0.05)。10 Western Blot检测各组大鼠肾皮质P-cadherin和TRPC6蛋白表达与C组比较,M组P-cadherin蛋白表达量显著下调(P<0.01);与M组比较,Q组和I组表达显著上调(P<0.01或P<0.05),且该两组间差异无统计学意义(P>0.05),H组和T组无明显上调(P>0.05);与Q组和I组比较,H组和T组相对降低(P<0.05或P<0.01)。与C组比较,M组TRPC6蛋白表达量显著升高(P<0.01);与M组比较,各治疗组TRPC6表达显著降低(P<0.05);且各治疗组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1高糖高脂饲料联合低剂量链脲佐菌素腹腔注射法制备的DKD大鼠模型基本成功,先后出现多饮、多食、多尿,逐渐出现蛋白尿,且符合相应的病理表现。2化瘀通络中药能够改善DKD大鼠一般情况和血脂紊乱状态、降低尿蛋白、保护肾功能、减轻病理损伤,起到肾保护作用。3化瘀通络中药可能通过上调P-cadherin和下调TRPC6蛋白表达,维持足细胞稳定性,减少尿蛋白,从而延缓DKD进展。4化瘀中药和通络中药同用,降低尿蛋白效果更佳,提示化瘀中药与通络中药合用配伍更合理,可能存在协同作用。通络中药下调血尿素氮和保护肾功能等方面效果优于化瘀中药。