海洋放线菌的分离筛选及其双组分信号转导系统功能的初步研究

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自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,为先导化合物以及新药的发现提供了不竭动力。而大多数的抗生素来源于放线菌的次级代谢产物,然随着从放线菌次级代谢产物中获得的抗生素大量问世,陆生放线菌资源日趋匮乏,再加上耐药性日益严重,使得研究者开始将目光延伸到资源丰富的海洋微生物,试图从海洋中分离到新的化合物。  海洋放线菌产生的活性物质结构新颖,常含有卤族元素或二硫键结构,且活性显著,有新的抗菌作用靶点,对肿瘤细胞和耐药性致病菌的抑制作用较强,现已成为研究的重中之重,并且高盐、高压、低温、低光照的海洋环境赋予了海洋放线菌独特的代谢方式和调控方式。大量研究表明双组分信号转导系统在调节抗生素等次级代谢产物的合成中发挥重要作用,本课题旨在对筛选菌株的TCS研究,阐明放线菌TCS的调控机制,了解TCS间相互作用,为进一步研究放线菌TCS的功能提供借鉴。  本实验对44份极端环境下的土样进行了放线菌的筛选与分离工作,并通过对比16S rDNA的手段将筛选到的放线菌进行了初步的分类,其中发现鉴定的8株放线菌均属于链霉菌属,其中I1,SR14,M01,STZ2,K1,TVG-purple这六株菌均能产生抑制指示菌生长的生物活性物质。放线菌TVG-purple还能够产生紫色素使整个菌落形态呈现紫色。通过提取纯化后发现放线菌TVG-purple产生的紫色素具有生物活性,并且能够很好的抑制玉米小斑菌和红色酵母菌的生长。  然后以能够产生生物活性物质的链霉菌TVG-purple为出发菌株,构建了其在大肠杆菌里的cosmid基因文库,并通过文库杂交的手段以及基因序列测序等确定了最终确定我们的目的菌株19#F5中4275/76位于中心位置,为最佳研究对象。确定19#F5菌株后我们将其质粒电转化到E..coli BW25113/pIJ790并通过PCR-targeting等手段将其中的4275/76基因进行了敲除从而获得缺失突变菌株,随后与野生菌株TVG-purple进行接合转移,使突变实现到TVG-purple中得到缺失突变菌株TVG-purple(△4275/76)。
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