[研究背景]随着人们生活水平的提高,2型糖尿病患病率在全球范围内呈逐年升高趋势,正逐渐成为威胁人类健康的“头号杀手”之一。近年来研究发现,2型糖尿病的发生机制除了与基因及饮食结构、体力活动等环境因素有关之外,还与肠道菌群关系密切。研究表明,2型糖尿病患者或动物模型与正常对照者相比肠道菌群构成发生了改变,这可能是引起胰岛素抵抗及糖尿病的因素。还有动物实验发现,通过改变饮食因素使肠道菌群构成发生变化能引起肥胖,进而增加糖尿病的风险。因此肠道菌群与代谢性疾病的发生发展密切相关,已成为国内外研究的新热点。人体消化道定植着相当复杂又相对稳定的肠道菌群,在能量代谢、免疫防御、合成人体必需的微量元素及矿物质等方面发挥着不可替代的作用。其中,乳酸杆菌普遍存在于人类消化道中,并且经常作为益生菌加入食品中。目前,肠道微生物与人类健康的相互作用仍存在分歧,它们影响人体代谢的机制仍不十分清楚。有实验发现,服用干酪乳酸杆菌能减轻大鼠的肥胖及胰岛素抵抗。然而也有实验表明,乳酸杆菌能引起炎症反应,而炎症反应又与肥胖及2型糖尿病有关。[目的]本研究拟从肠道菌群角度,应用实时荧光定量PCR技术,比较我国2型糖尿病人群与血糖正常人群肠道总乳酸杆菌及其具体菌种(嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)数量的差异,并且分析乳酸杆菌数量与血糖、血脂等代谢性指标的相关性,从而为2型糖尿病的发病机制提供新线索,为2型糖尿病的防治寻求新靶点。[方法]选取2010年8月——2010年10月在广东某社区医院病房住院及门诊随诊的2型糖尿病病人50人,同时选取30名健康对照者,性别、年龄、BMI相匹配,并排除肿瘤、肝肾等脏器严重损害、患有甲状腺等其它内分泌疾病、1月内服用抗生素及微生态制剂、近4周内患腹泻病或其它胃肠道疾病者。收集每个2型糖尿病患者空腹血样品,进行空腹血糖(FBG)、胰岛素、C肽、糖化血红蛋白(HbA1C)、血脂(包括TC、LDL-C、HDL-C、TG)、C反应蛋白(CRP)浓度测定,进行OGTT试验,收集2h后血样品进行餐后2h血糖(PBG)、胰岛素、C肽浓度测定。收集每个研究对象当日粪便样品,称取湿重粪便样品每份2g,经反复离心、去除杂质、洗涤,得到菌体沉淀,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。根据待测目标细菌16SrRNA基因序列设计特异性引物,将10倍系列稀释的标准品与粪便细菌DNA样品同时进行实时荧光定量PCR反应,每次反应体系和反应条件均相同,每次实验同时设标准品及空白对照,每个样品均同时做2个平行复孔。反应完毕后根据熔解曲线分析PCR产物的特异性,根据Ct值及标准曲线计算每克粪便样品中待测细菌基因的拷贝数,作为定量结果。将此定量结果经log10转换后录入SPSS17.0统计软件进行分析。应用两独立样本t检验比较组间差异。用K类中心聚类法根据所含细菌数目的差异将所有研究对象分成相互独立的两类,用两独立样本t检验比较两类间目标细菌的差异,用两独立样本率比较的χ2检验比较两类中糖尿病患者的百分比来判断该分类方法与糖尿病之间是否存在关联,并计算敏感性、特异性。用Pearson相关分析总乳酸杆菌拷贝数与糖尿病患者脂代谢指标、糖代谢指标、炎症指标的相关性。以P(0.05为差异有统计学意义。[结果]用两独立样本t检验对乳酸杆菌属及其具体菌种实时定量PCR结果进行统计学分析,糖尿病组(7.771±0.874)乳酸杆菌含量显著高于对照组(6.606±0.586)(P<0.001)；糖尿病组(4.550±0.674)嗜酸乳杆菌含量显著高于对照组(2.904±0.614)(P<0.001)；糖尿病组(5.016±1.047)干酪乳杆菌含量显著高于对照组(4.504±0.938)(P=0.031)；糖尿病组(5.188±0.681)保加利亚乳杆菌含量显著高于对照组(4.550±0.674)(P<0.001)；糖尿病组(3.744±0.995)鼠李糖乳杆菌含量显著高于对照组(2.730±0.459)(P<0.001)；糖尿病组(4.698±0.938)植物乳杆菌含量低于对照组(4.619±0.657),但差异不具有显著性(P=0.685)。通过聚类分析得到相互独立、菌群构成特征不同的两类,其中第一类含有显著增多的总乳酸杆菌(7.8±0.9P<0.001)、嗜酸乳杆菌(5.2±1.0P<0.001)、保加利亚乳杆菌(5.2±0.6P=0.038)、干酪乳杆菌(5.2±1.2P=0.007)及鼠李糖乳杆菌(4.0±1.1P<0.001),第二类含有显著减少的总乳酸杆菌(7.0±0.9P<0.001)、嗜酸乳杆菌(2.9±0.6P<0.001)、保加利亚乳杆菌(4.8±0.8P=0.038)、干酪乳杆菌(4.6±0.8P=0.007)及鼠李糖乳杆菌(2.9±0.6P<0.001)。且该分类与糖尿病之间存在联系,第一类中糖尿病患者所占百分比显著高于第二类(χ2=25.368P<0.001)。本实验通过肠道菌群分析预测糖尿病的敏感性为0.600,特异性为0.967。Pearson相关分析结果显示乳酸杆菌与脂代谢指标显著相关,与糖代谢指标、炎症指标之间未发现显著相关性。总乳酸杆菌与低密度脂蛋白胆固醇显著负相关(RP=0.252P=0.039),与总胆固醇(RP=0.215P=0.067)、甘油三酯(RP=0.161P=0.132)、高密度脂蛋白胆固醇(RP=0.157P=0.138)呈负相关,但相关性不具有统计学意义。[结论]本研究通过对乳酸杆菌属及具体菌种的定量分析比较,可以初步认为：乳酸杆菌及其具体菌种嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌在2型糖尿病人群和血糖正常人群中存在差异,2型糖尿病人群中上述菌属及菌种增多。且研究结果显示通过分析肠道菌群构成的方法来判断糖尿病的风险具有较高的特异性,为2型糖尿病高危人群的判断及2型糖尿病早期防治提供了新的线索。在所有代谢指标中,发现低密度脂蛋白胆固醇与乳酸杆菌显著负相关。可以推测,肠道菌群对血脂代谢具有一定的调节作用。通过饮食调节肠道乳酸杆菌含量可能有助于改善糖尿病、高脂血症等代谢性疾病。