很多养殖鱼类的生长具有二态性,如罗非鱼的雄性比雌性生长快50%,单性养殖成为提高水产养殖效益的有效手段之一,性别决定研究为性控育种提供理论基础。迄今为止,已在多种鱼类中发现其性别决定基因,这些基因能决定相关物种雄性性别。然而对鱼类雌性性别决定基因的鉴定还鲜有报道。Foxl2是Fox基因家族的成员,哺乳动物缺失Foxl2会发生由雌向雄的部分或完全性逆转,说明Foxl2参与哺乳动物雌性性别决定或维持。鱼类中研究结果表明,foxl2表达存在性差,在卵巢表达高于精巢,前期研究结果显示,在XX罗非鱼(XY型性别决定系统)中过表达foxl2显负性突变体或敲降foxl2都会性逆转为雄性,近期在斑马鱼中突变foxl2也会导致由雌向雄性逆转,表明Foxl2参与了鱼类雌性性别决定,但其作用机制还不清晰。cyp19a1a编码的芳香化酶是雌激素合成关键限速酶,已证明Foxl2能直接与cyp19a1a启动子结合,促进其转录。前期结果显示在XX罗非鱼中敲降Cyp19a1a导致由雌向雄性逆转,近期在斑马鱼和青鳉中的突变实验也得到相同结果。另外,雌激素在哺乳动物雄性生殖中也扮演了重要角色,阻断雌激素通路导致雄性小鼠输精管堵塞,引发不育。而与哺乳类不同,突变斑马鱼cyp19a1a和其复制基因cyp19a1b没有引起雄性生殖缺陷。因此,雌激素在鱼类雄性生殖中的功能还有待进一步证明。实验室前期结果显示XY罗非鱼精巢表达Cyp19a1b而不表达Cyp19a1a,据此推测XY罗非鱼的雌激素来源可能主要由Cyp19a1b催化合成。为了深入研究Foxl2/Cyp19a1a在雌性性别决定和Cyp19a1b在雄性生殖中的作用,本研究在实验室前期基础上获得foxl2、cyp19a1a、cyp19a1b纯合突变鱼。具体研究结果如下:1、在罗非鱼中获得外显子缺失2 bp foxl2(单外显子基因)纯合突变鱼。在孵化后90天取样分析发现,foxl2 XX突变个体发育为雄性;与对照XX性腺相比,免疫组化和Western blot分析显示XX突变性腺中雄性通路基因(Sf1、Dmrt1和Gsdf)表达上调;Real-time PCR分析显示XX突变性腺中雌性通路基因(β-cat1、β-cat2和figla)表达下调。与XX雌鱼交配发现XX突变鱼和对照XY雄鱼的育性没有显著性差异。Dmrt1在孵化后5和30天foxl2 XX突变和对照XY性腺中表达,而不表达于对照XX性腺;Cyp19a1a在孵化后5、30和90天对照XX性腺中表达,而不在XX突变和XY对照性腺中表达。表明foxl2 XX突变性腺在孵化后5天时已向精巢发育。血清雌激素水平在XX突变鱼中显著降低;用外源雌激素处理孵化后5天XX突变鱼,处理至孵化后30天,正常饲养至孵化后60天,发现外源雌激素能够回救Foxl2缺失引起的性逆转。表明Foxl2缺失后的由雌向雄性逆转是由于Cyp19a1a表达下调导致雌激素合成不足引起的。另一方面,与对照XY鱼相比,foxl2 XX突变鱼中Cyp11b2表达和血清雄激素水平显著性上调。前期结果显示Star1(Star1负责转运胆固醇进入线粒体,供类固醇酶催化合成激素)在罗非鱼精巢中表达,而不表达于卵巢,与XY鱼中雄激素的合成密切相关。在star1启动子上存在Foxl2结合位点,启动子分析发现Foxl2对star1转录具有剂量依赖的抑制作用;在孵化后30和90天,Star1在XX foxl2突变性腺中表达上调。该结果表明Foxl2缺失激活Star1依赖的雄激素合成通路,促进性逆转精巢的精子发生和成熟。罗非鱼与其它脊椎动物一样,早期性腺中的生殖细胞存在差异,雌性中显著多于雄性。在孵化后10天检测分析发现,与对照XX性腺性比,XX突变性腺中生殖细胞数量显著减少。我们推测Foxl2可能参与调控罗非鱼早期生殖细胞增殖。2、在罗非鱼中获得第一个外显子缺失7 bp的cyp19a1a纯合突变鱼。在孵化后90天取样观察发现,cyp19a1a XX突变个体发育为雄性。与对照XY性腺一致,孵化后5、30和90天XX突变性腺表达Dmrt1。与对照XX鱼相比,突变鱼血清雌激素水平显著降低;Western blot分析表明Sf1、Dmrt1、Gsdf和Cyp11b2在突变性腺中显著上调;real-time PCR分析显示β-cat1、β-cat2和figla在cyp19a1a XX突变性腺中显著下调。与XX雌鱼交配发现XX突变鱼和对照XY鱼的育性没有显著性差异。与foxl2 XX突变鱼相同,cyp19a1a XX突变鱼的性逆转表型能够被外源雌激素回救,而不同的是,当停止雌激素处理,cyp19a1a XX性腺又向精巢逆转。同于foxl2 XX突变性腺,孵化后10天cyp19a1a XX性腺中生殖细胞数量显著减少,说明雌激素也可能参与调控罗非鱼早期生殖细胞增殖,进而决定生殖细胞的雌性命运。3、在罗非鱼中获得第二个外显子缺失8 bp的cyp19a1b纯合突变鱼。在孵化后240天取样分析发现,cyp19a1b XY突变个体血清雌激素水平显著降低;与正常XX雌性交配,XY突变鱼不能获得后代;体外挤压突变鱼腹部不能挤出精液。该结果说明Cyp19a1b突变导致雌激素合成不足,引发XY罗非鱼不育。解剖观察发现突变个体性腺异常膨大,GSI显著增大。组织学观察显示cyp19a1b XY突变性腺输精管变细,输精管指数显著减小。解剖性腺后发现cyp19a1b XY突变性腺中有大量形态正常的精子;精子质量分析仪测定结果显示突变和对照精子的精子活力、平均曲线运动速度、鞭毛拍频和笔直精子所占比例没有显著性差异,与对照XX雌鱼鱼卵受精的结果表明两者的受精能力也不存在显著性差异;real-time PCR分析显示突变性腺中生殖细胞相关基因(vasa、nanos2、piwil1和dazl)和精子发生相关基因(fshr、lhr、sycp3、spo11、aspm、suz12a、cdk16和dusp26)表达水平没有发生显著性变化。暗示雌激素不参与调控罗非鱼精子发生和成熟。与对照相比,突变个体输精管低卷积、少分支,输精管壁上的血管消失,离子交换相关基因(aqp1ab、slc12a7b、slc20a1a、slc26a1、slc26a3和slc9a6b)表达水平显著下调,说明在雌激素不足的情况下,输精管管腔内离子交换不能正常进行;突变个体输精管上皮细胞和精巢部分体细胞中TUNEL阳性细胞增多,突变性腺中凋亡相关基因(aqp1ab、slc12a7b、slc20a1a、slc26a1、slc26a3和slc9a6b)表达水平显著上调;在孵化后360天检测发现,突变精巢表现为短精巢和输精管异常暴露,输精管纤维化,后半部分精巢退化严重,几乎没有精子存在,前半部分精巢退化较弱,有大量精子存在;突变个体GSI显著降低。这些结果说明输精管堵塞会诱发精巢退化。从突变个体前半部分精巢中收集到的精液可以使鱼卵受精,受精能力与对照组没有显著性差异。综上所述,本研究在罗非鱼中获得foxl2、cyp19a1a、cyp19a1b纯合突变鱼,foxl2 XX突变鱼和cyp19a1a XX突变鱼都发生由雌向雄性逆转,这种性逆转能够被外源雌激素回救。Foxl2通过上调Cyp19a1a表达、促进生殖细胞增殖和抑制雄性通路基因表达来维持雌性性别和卵巢发育,初步阐明Foxl2和Cyp19a1a在雌性性别决定中的作用机制,为水产养殖性控育种提供理论基础。Cyp19a1b缺失导致XY罗非鱼雌激素合成不足,输精管堵塞,引发不育,进而引发精巢退化和输精管纤维化。与哺乳类相同,雌激素为鱼类雄性个体的育性所必须。